人源性老年癡呆單鏈?zhǔn)删w抗體庫(kù)的構(gòu)建

蘇雪瑩 趙振富 徐 杰 汪華僑 初國(guó)良

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154002)

抗體庫(kù)技術(shù)是利用基因工程技術(shù)，在細(xì)菌中構(gòu)建人類或某種動(dòng)物所有抗體基因的表達(dá)文庫(kù)，用以篩選某種抗原的特異性抗體〔1〕。它克服了傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體遇到的難題，如融合效率不高、雜交瘤不穩(wěn)定、抗體產(chǎn)量低等。人們已通過(guò)抗體庫(kù)技術(shù)成功的篩到了腫瘤的特異性抗體或相關(guān)性抗體〔2〕。阿爾茨海默病(AD)是以β淀粉樣蛋白(Aβ)過(guò)量產(chǎn)生并病理性沉積，引起記憶及認(rèn)知能力進(jìn)行性衰退為特征的一種神經(jīng)退行性疾病。近期的研究表明，抗Aβ抗體，包括抗體的Fab片段及/或者單鏈可變區(qū)抗體片段在阻止和延遲AD病人病理改變中起重要的作用〔3～6〕。然而，鼠源性的抗體由于可以引起人體產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)，從而限制了其作為診斷和治療藥物在人體上的應(yīng)用。而人源性單鏈抗體(scFv)庫(kù)是制備人源化單克隆抗體(mAb)最有效的方法之一。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)利用臨床確診AD病人的外周血B淋巴細(xì)胞，利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，首次構(gòu)建了AD病人的單鏈可變區(qū)噬菌體抗體庫(kù)，為進(jìn)一步篩選AD相關(guān)抗原的人源性抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①人外周血B淋巴細(xì)胞:來(lái)自于20例臨床診斷明確的AD病人的200 ml外周血;②菌株及質(zhì)粒:大腸桿菌XLIBlue為本室保存，質(zhì)粒pDAN5為顏錫蘊(yùn)教授(中科院生物物理研究所)饋贈(zèng)，M13KO7輔助噬菌體為本室保存;③試劑:淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)，Trizol reagent(Gibco公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)，ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶BssHⅡ、SalⅠ、XhoⅠ、NheⅠ、BstNⅠ(大連寶生物公司)，酶切DNA片段回收采用Omega Gel Extraction Kit，質(zhì)粒小量提取采用Omega Plasmid Mini Kit。1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 淋巴細(xì)胞分離液分離200 ml AD病人外周血淋巴細(xì)胞，尼龍毛柱法提取B淋巴細(xì)胞;Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，采用隨機(jī)六引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 VH、VL基因片段的擴(kuò)增 ①引物的設(shè)計(jì):根據(jù)人免疫球蛋白家族的保守序列，即第一框架區(qū)(F1)和連接區(qū)(J區(qū))設(shè)計(jì)引物，共30條，可以擴(kuò)增出全部人抗體的可變區(qū)片段。②引物的保護(hù)序列:擴(kuò)增VH基因片段5'端引物保護(hù)序列為:TATC-_CTCGAGCGGTACC(下劃線處為 XhoⅠ酶切位點(diǎn))，3'端為:GGCGGATGCGCTAGC(下劃線處為NheⅠ 酶切位點(diǎn));擴(kuò)增VL基因片段5'端引物保護(hù)序列為:TAATGCGCGCATGCC(下劃線處為BssHⅡ酶切位點(diǎn))，3'端為:GGTCGACCCTCCGGAACG(下劃線處為SalⅠ酶切位點(diǎn))。③PCR擴(kuò)增:由于引物數(shù)量較多，且都是簡(jiǎn)并引物，因此為方便擴(kuò)增，將VH基因的4條3'端引物混合，與7條5'端引物分別擴(kuò)增VH基因片段;將Vλ基因的2條3'端引物混合，與9條5'端引物分別擴(kuò)增Vλ基因片段;將Vκ的4條3'端引物混合，與4條5'端引物分別擴(kuò)增Vκ基因片段。以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，反應(yīng)條件:熱啟動(dòng)94℃，5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 VL基因片段的純化和克隆 PCR擴(kuò)增出的抗體VH和VL基因片段上樣，15 g/L瓊脂糖電泳，紫外燈下切取凝膠上的目的條帶，按Omega公司的Gel Extraction Kit說(shuō)明書操作，進(jìn)行純化。純化后的VL基因片段分別用BssHⅡ、SalⅠ雙酶切，酶切后的片段凝膠純化回收后，與同樣雙酶切并凝膠回收的pDAN5質(zhì)粒以3∶1的比例，16℃反應(yīng)16 h連接，連接完畢后70℃作用10 min滅活T4連接酶，電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLIBlue。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌鋪到含10 mg/L四環(huán)素、100 mg/L氨芐西林的LB瓊脂板上，37℃過(guò)夜。次日，刮下全部陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)移到200 ml含20 g/L葡萄糖、10 mg/L四環(huán)素、100 mg/L氨芐西林的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜，提取重組質(zhì)粒pDAN5-VL。

1.2.4 VH基因片段的純化和克隆 純化后的VH基因片段分別用XhoⅠ、NheⅠ雙酶切，酶切后的片段凝膠純化回收后，與同樣雙酶切并凝膠回收的pDAN5-VL質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLI-Blue(同上VL基因片段的克隆)。

1.2.5 抗體庫(kù)的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌鋪板過(guò)夜培養(yǎng)，刮取全部陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)移至含 20 g/L葡萄糖、10 mg/L四環(huán)素、100 mg/L氨芐西林的2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)至A600=0.5時(shí)，按20∶1的比例加入輔助噬菌體M13KO7超感染，感染后的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至含20 g/L葡萄糖、100 mg/L氨芐西林、50 mg/L卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中30℃過(guò)夜培養(yǎng)，收集全部重組噬菌體，最終保存為初級(jí)單鏈?zhǔn)删w抗體庫(kù)。

1.2.6 抗體庫(kù)的鑒定 ①PCR鑒定:噬菌體感染對(duì)數(shù)期大腸桿菌XLI-Blue后，隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒pDAN5，以質(zhì)粒為模板，利用特異性上、下游引物PCR擴(kuò)增scFv目的條帶，結(jié)果用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶;②雙酶切鑒定:以BssHⅡ和NheⅠ雙酶切隨機(jī)提取的10個(gè)陽(yáng)性克隆pDAN5噬菌粒，結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè);③抗體庫(kù)多樣性鑒定:取PCR擴(kuò)增回收的scFv基因片段，BstNⅠ內(nèi)切酶酶切并進(jìn)行指紋圖譜鑒定，結(jié)果用40 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 從AD病人外周血共分離出2×108的B淋巴細(xì)胞，從中提取總RNA，稀釋后紫外分光光度計(jì)測(cè)定其260 nm/280 nm=1.96，總RNA量為0.48 mg，可滿足進(jìn)一步合成cDNA的要求。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分10管進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后混合所有反應(yīng)產(chǎn)物。

2.2 VH、VL基因片段的擴(kuò)增 以合成的cDNA為模板，一半擴(kuò)增 VH、一半擴(kuò)增 VL，每50 μl反應(yīng)體系取0.5 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，所有逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物全部擴(kuò)增后，分別收集PCR產(chǎn)物，用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增出所有VH、VL目的基因片段(7組VH基因和13組VL基因:4組Vκ，9組Vλ)，其大小約350 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。見(jiàn)圖1。

2.3 抗體庫(kù)的鑒定

2.3.1 抗體庫(kù)的PCR鑒定 從構(gòu)建的抗體庫(kù)中隨機(jī)挑取10個(gè)克隆，以特異性引物擴(kuò)增scFv目的片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示10個(gè)克隆均擴(kuò)增出明顯的scFv目的條帶，其大小約800 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。見(jiàn)圖2。

2.3.2 抗體庫(kù)的酶切鑒定 以BssHⅡ和NheⅠ內(nèi)切酶雙酶切提取的10個(gè)陽(yáng)性克隆的pDAN5噬菌粒，酶切后產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示10個(gè)克隆均成功克隆入scFv目的片段，其大小約750 bp。見(jiàn)圖3。

2.3.3 抗體庫(kù)的多樣性檢測(cè) 取經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠回收的scFv片段，BstNⅠ內(nèi)切酶酶切(BstNⅠ的酶切位點(diǎn)隨機(jī)分布于抗體可變區(qū)基因中)，40 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行指紋圖譜鑒定，結(jié)果顯示各克隆的scFv片段BstNⅠ消化后的指紋圖譜各不相同，提示構(gòu)建的噬菌體單鏈抗體庫(kù)中每個(gè)克隆的scFv片段都不同。見(jiàn)圖4。構(gòu)建的抗體庫(kù)經(jīng)梯度稀釋后，計(jì)算得出本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的AD噬菌體抗體庫(kù)的庫(kù)容量是1.5×106。

圖1 VH和VL基因片段的擴(kuò)增

圖2 抗體庫(kù)的PCR檢測(cè)

圖3 抗體庫(kù)的酶切檢測(cè)

圖4 不同克隆ScFv片段BstNⅠ消化后的指紋圖譜

3 討論

抗體庫(kù)的多樣性(指抗體庫(kù)中含不重復(fù)克隆的數(shù)目)對(duì)隨后篩選出高親和力的抗體很重要，其多樣性主要決定于兩個(gè)因素:①B淋巴細(xì)胞數(shù)目:B細(xì)胞的數(shù)目是決定抗體庫(kù)多樣性的首要因素。一個(gè)B細(xì)胞含有一種抗體基因，欲構(gòu)建大容量、高質(zhì)量的抗體庫(kù)，其抗體基因的來(lái)源必須保證有足夠的多樣性。人類天然抗體庫(kù)的重鏈即有107的多樣性，輕鏈基因有105，只有淋巴細(xì)胞的量達(dá)到這個(gè)數(shù)量級(jí)，才有可能將每一種抗體基因都擴(kuò)增出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)從20例AD患者的200 ml外周血中分離B淋巴細(xì)胞，經(jīng)計(jì)數(shù)其數(shù)量達(dá)到2×108，這就為成功構(gòu)建大庫(kù)容量的抗體庫(kù)提供了最初的保證;②引物的設(shè)計(jì)選擇:在保證抗體基因來(lái)源的情況下，要盡可能擴(kuò)增出全部抗體基因，避免某個(gè)或某些家族基因的丟失，引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。一般是用第一框架區(qū)(FR1)和第四框架區(qū)(FR4)保守序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物。不同的研究人員所采用的引物對(duì)于全套抗體的擴(kuò)增效率是不同的，如Marks等的引物擴(kuò)增效率是59.5%，Welschof等的引物擴(kuò)增效率是62.8%。而1998年Bradbury報(bào)道的擴(kuò)增人抗體可變區(qū)基因(VH和VL)的一組引物，經(jīng)系列檢測(cè)，證實(shí)其擴(kuò)增效率為100%。本實(shí)驗(yàn)在引物的選擇上，采用了Bradbury報(bào)道的引物組序列，并加上相應(yīng)的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。從PCR的結(jié)果可以看出，抗體每一個(gè)家族的成員都被成功地?cái)U(kuò)增了出來(lái)，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)選用的引物其擴(kuò)增效率為100%。

抗體對(duì)AD的治療作用目前已成為學(xué)者們的共識(shí)，近來(lái)的研究證實(shí)，單克隆抗體的片段，如F(ab)2和scFv，同樣可以有效抑制 Aβ 的聚集，阻礙 Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用〔5，6，8〕。單鏈可變區(qū)抗體片段不含全抗體的Fc段，因此在結(jié)合AD相關(guān)蛋白，如Aβ肽時(shí)，不會(huì)啟動(dòng)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，限制了炎癥反應(yīng)。同樣，用單鏈抗體做被動(dòng)免疫不會(huì)激活T細(xì)胞，也不會(huì)激活可以引起廣泛炎癥反應(yīng)的小膠質(zhì)細(xì)胞。此外，單鏈抗體與全抗體比較還有較低的分子量，使其更容易穿過(guò)血腦屏障入腦，因此單鏈可變區(qū)抗體片段對(duì)AD來(lái)講，是一種具有很好發(fā)展前景的免疫治療途徑〔6〕。

盡管單鏈抗體存在著諸多的優(yōu)點(diǎn)，使其具有廣泛的應(yīng)用前景，但也存在有自身的缺點(diǎn)，其中最主要的缺點(diǎn)就是親和力較低，一般只能達(dá)到機(jī)體初級(jí)免疫時(shí)抗體的親和力水平。對(duì)此問(wèn)題的解決方法是構(gòu)建大庫(kù)容量的噬菌體抗體庫(kù)，或者對(duì)篩選到的抗體進(jìn)行體外的親和力成熟。免疫抗體庫(kù)由于抗體可變區(qū)基因均來(lái)源于經(jīng)過(guò)某種抗原免疫的，已分化的漿細(xì)胞或者記憶性B細(xì)胞，其分泌的抗體在體內(nèi)已經(jīng)經(jīng)歷了親和力成熟的過(guò)程，因此即使在庫(kù)容量不大的情況下，也可以比較容易地篩選出高親和力的抗體。Portolano等〔9〕報(bào)道從免疫抗體庫(kù)中克隆的抗體親和力達(dá)到10－9M水平，而庫(kù)容量?jī)H有2×106;而抗體庫(kù)用沒(méi)有免疫機(jī)體的其他抗原篩選時(shí)，其抗體親和力降低十倍。這表明免疫抗體庫(kù)對(duì)于篩選特定抗原的片段抗體是非常合適的。本實(shí)驗(yàn)利用20個(gè)AD病人外周血B細(xì)胞，首次構(gòu)建了AD病人的噬菌體單鏈抗體庫(kù)。由于AD病人外周血中Aβ肽等蛋白的滴度遠(yuǎn)高于正常人，其自身的抗體必然經(jīng)歷了一個(gè)親和力成熟的過(guò)程，因此該抗體庫(kù)可被認(rèn)為是一個(gè)人源的“免疫”單鏈抗體庫(kù)，而這些B細(xì)胞中必然包含多種多樣的對(duì)AD相關(guān)蛋白有高特異性及親和力的抗體基因。與天然抗體庫(kù)和合成抗體庫(kù)相比，免疫抗體庫(kù)更容易篩選到接近自然狀態(tài)的，具高特異性和親和力的抗體〔10〕。因此，從本文構(gòu)建的這樣一個(gè)“免疫”噬菌體抗體庫(kù)中，以特異的AD相關(guān)蛋白為靶點(diǎn)，篩選出接近自然狀態(tài)的中和Aβ的抗體是極具可行性的。

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