高壓氧預處理對正常和糖尿病大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響

谷莉娜 鄭 楊 王奭驥 谷鐵軍 (吉林大學第一醫院，吉林 長春 3002)

細胞凋亡(Apoptosis)，又稱細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。近年研究發現，細胞凋亡參與心肌梗死心肌細胞的死亡，并在心室重構、心功能改變過程中起關鍵作用〔1〕。本研究觀察高壓氧預處理對正常和糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的影響，并檢測正常和糖尿病大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表達水平的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 75只健康成年雄性Wistar大鼠，體重250～350 g，由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供。

1.2 儀器及試劑 動物實驗高壓氧艙(煙臺冰輪高壓氧艙有限公司);BL-420生物機能試驗系統(成都泰盟科技有限公司);電子天平ESJ60-4(沈陽龍騰電子有限公司);電子天平HX5CC1(慈溪市天東衡器廠);灌流液濾過裝置(吉林大學基礎醫學院藥理學院);Langerdorff離體灌流裝置(沈陽國藥集團定制);光學顯微鏡BX51(日本OLYMPUS公司 );石蠟切片機RM 2245(德國LEICA公司);免疫組化檢測試劑盒和Bcl-2、BaX抗體，購自北京博奧森生物技術有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 2型糖尿病(T2DM)動物模型建模方法 取45只成年雄性Wistar大鼠高脂飼料(88.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%豬油和0.2%膽鹽)飼養1個月后給予大鼠2%STZ一次性腹腔注射(40 mg/kg)，1 w后取尾血測血糖，以血糖＞16.7 mmol/L為糖尿病模型成功。大鼠繼續常規飼料喂養2個月。

1.3.2 分組及干預 將75只大鼠分為正常組(30只)和糖尿病組(45只)。正常組分為正常對照組(N-C組，n=10):以KH液持續灌流120 min;正常缺血-再灌注組(N-I/R組，n=10):以K-H液穩定灌流 20 min后，停止灌流 30 min，再灌注120 min;正常高壓氧預處理組(N-P組，n=10):該組大鼠經過高壓氧預處理后，其余實驗方法同I/R組。造模成功的T2DM大鼠隨機分為糖尿病對照組(DM-C組，n=10):以K-H液持續灌流120 min;糖尿病缺血-再灌注組(DM-I/R組，n=10):以KH液穩定灌流20 min后，停止灌流30 min，再灌注120 min;糖尿病高壓氧預處理組(DM-P組，n=10):該組大鼠經過高壓氧預處理后，其余實驗方法同I/R組。高壓氧預處理的方法:每天先洗艙，以保證艙內處于純氧狀態。然后將大鼠放進動物實驗高壓氧艙內，以0.2 ATA/min注入純氧，至壓力達到2.0 ATA(標準大氣壓)。當壓力穩定后，將大鼠放置60 min。達到規定時間后，以0.2 ATA/min排放艙內氧氣，至艙內壓力恢復至正常。1次/d，共7 d。

1.3.3 離體大鼠心臟灌流(Langendorff)模型 Langendorff模型是在恒溫恒壓條件下，從主動脈根部用氧飽和的K-H灌流液逆向灌流，因逆向灌注關閉了主動脈瓣，類似于在體心臟處于舒張期，停止灌流即模擬全心缺血狀態，恢復灌流即全心再灌注開始。具體步驟:取大鼠，秤體重，按5 ml/kg給予20%烏拉坦腹腔注射麻醉后，置于動物臺上，固定四肢。迅速開胸取出心臟并立即置于4℃ K-H緩沖液中，輕輕擠壓心室，使心腔中殘余血排除。開啟Langendorff灌流裝置，流量約10 ml/min于液面下在1 min內迅速把主動脈接于灌流的套管上，將大鼠心臟懸掛于Langendorff裝置上，并以絲線結扎固定。用95%O2～5%CO2平衡的37℃ K-H液行主動脈逆行恒壓灌流，灌流壓力為80 cmH2O。剪去左心耳，將帶有水囊的壓力換能器(事先應排盡空氣)通過左心房插入左心室。壓力換能器的另一端接于BL-420生物機能試驗系統，由其記錄血流動力學變化。

1.3.4 標本制備 灌流畢，速取心臟于4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋，每隔1 mm橫斷面切數張4 μm厚的切片，分別做HE染色、心肌細胞凋亡、Bax與Bcl-2表達檢測。

1.3.5 TUNEL法原位檢測心肌細胞凋亡 取各組心肌細胞切片放入4%甲醛溶液固定，按TUNEL試劑盒說明書原位檢測凋亡細胞，細胞核呈黃褐色為凋亡細胞。每張切片隨機計數5個以上視野，分別計算每個視野細胞核數及凋亡陽性細胞核數，根據如下方法計算凋亡指數(AI)，AI(%)=凋亡陽性的細胞核數/總計數的細胞核×100%。

1.3.6 采用免疫組化法檢測Bcl-2與Bax表達 利用圖形分析系統分別對細胞凋亡和Bcl-2與Bax陽性細胞灰度值進行測定，求取每個視野均值代表該切片的測量值，以表示其染色強度。平均灰度值與陽性細胞表達成反比，平均灰度值越高，表示指標的陽性染色數量越少;平均灰度值越低，表示指標的陽性染色數量越多。

1.4 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件，計量資料以表示，組間數據比較用t檢驗。

2 結果

2.1 心肌組織病理學分析 圖1可見，染色見正常對照組大鼠心臟結構完整、清晰，心肌細胞排列整齊略松散，偶見炎細胞浸潤。正常缺血-再灌注組:心肌細胞排列不規則，細胞腫脹可見心肌細胞質嗜酸性增強，有大量炎細胞浸潤;正常高壓氧預處理組:心肌細胞排列較規則，細胞略腫脹，可見心肌細胞質嗜酸性增強，有少量炎細胞浸潤，病變較正常缺血再灌注組輕;糖尿病大鼠對照組見心臟結構完整、清晰，心肌細胞排列較為整齊，偶見炎細胞浸潤及胞質嗜酸性略增強;糖尿病大鼠缺血-再灌注組見心肌細胞排列不規則，細胞腫脹可見心肌細胞質嗜酸性增強，有大量炎細胞浸潤;糖尿病高壓氧預處理組見心肌細胞排列不規則，細胞腫脹可見心肌細胞質嗜酸性增強，有少量炎細胞浸潤，病變較糖尿病缺血再灌注組輕。

2.2 心肌細胞凋亡變化 圖2可見，正常及糖尿病對照組均可見少量陽性凋亡細胞;正常及糖尿病缺血-再灌注組心肌細胞凋亡均明顯增多，但糖尿病缺血-再灌注組比正常缺血-再灌注組凋亡增多更明顯;正常及糖尿病高壓氧預處理組仍可見較多凋亡細胞，但比缺血-再灌注組明顯減少，其中正常大鼠高壓氧預處理組凋亡細胞減少更明顯。見表1。

圖1 心肌組織病理學分析(HE，×200)

圖2 心肌細胞凋亡變化(TUNEL染色，×200)

表1 心肌細胞凋亡指數(，%)

表1 心肌細胞凋亡指數(，%)

與N-C組比較:1)P＜0.05;與N-I/R組比較:2)P＜0.05;與DM-C組比較:3)P＜0.05;與DM-I/R組比較:4)P＜0.05，下表同

10 5.0±0.98 N-I/R組 10 41.72±3.471)N-P組 10 33.15±4.362)DM-C組 10 8.56±2.33 DM-I/R組 10 52.73±6.713)DM-P組 10 41.69±5.794)凋亡指數N-C組組別 n

2.3 心肌細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達水平 正常及糖尿病缺血-再灌注組Bcl-2的表達均明顯減少，Bax的表達均明顯增多，與對照組比較有統計學意義(P＜0.05)，但糖尿病組更為明顯;正常及糖尿病高壓氧預處理組Bcl-2的表達均明顯增多，Bax的表達均明顯減少，與缺血-再灌注組比較有統計學意義(P＜0.05)，但正常組更明顯。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達的平均灰度比較(，n=10)

表2 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達的平均灰度比較(，n=10)

127±9.12 177.67±4.59 N-I/R組 171.83±8.661) 157.50±8.121)N-P組 158.67±7.692) 170.17±7.352)DM-C組 150.33±7.65 149.33±7.94 DM-I/R組 183.33±9.153) 134.0±4.733)DM-P組 166.0±10.534) 141.17±6.774)Bcl-2 Bax N-C組組別

3 討論

糖尿病是冠心病的主要危險因素，急性心肌梗死糖尿病人群的死亡率也高于非糖尿病人群。已發現，在糖尿病損傷的心肌組織中存在著大量的凋亡細胞〔2，3〕，心肌細胞凋亡可能是心臟結構和功能發生改變的關鍵因素。Bcl-2和Bax基因是調控凋亡的主要基因，Bcl-2基因是一原癌基因，能抑制細胞凋亡，其過量表達可阻斷因缺血、細胞因子短缺、輻射、抗腫瘤藥物、cmyc等不同刺激誘發的細胞凋亡。Bcl-2抑制凋亡的機制是它可直接或間接地阻止細胞色素自線粒體的釋出，而后者可與ATP一起改變Apaf-1的構型而使caspase-9激活。Bax基因為促進凋亡基因，主要表達于線粒體膜和內質網膜上。Bax與Bcl-2有很高的同源性，能與Bcl-2形成異源二聚體，通過抑制后者的活性，使凋亡易于發生。Bcl-2和Bax的表達程度決定了細胞命運，Bcl-2占優勢時阻止細胞凋亡發生，而Bax占優勢時細胞趨向凋亡。

人們把超過1個大氣壓的壓力稱高氣壓。在高氣壓環境中吸入高濃度氧或純氧，使氧壓或氧分壓大于常壓純氧水平的氧，即稱為高壓氧。高壓氧條件下可使物理溶解氧量顯著增多，可使局部血管擴張，增加該地區的血流量，可明顯改善缺血、缺氧組織血供，增強微循環功能。高壓氧作用下氧的有效彌散半徑加大，彌散深度和范圍增加，這就使得在一般常壓下無法深達的組織細胞可獲得足夠的氧的供應，增加組織儲氧量，糾正缺氧。因此高壓氧廣泛應用于治療缺血缺氧性疾病。研究表明〔4～7〕，高壓氧預處理可減輕大鼠的心肌缺血-再灌注損傷。但高壓氧預處理對大鼠心肌細胞凋亡的影響，特別是對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的影響至今未見報道。

本實驗利用離體灌流模型觀察高壓氧預處理對正常和糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的影響。本實驗表明正常及糖尿病大鼠缺血-再灌注組與對照組相比心肌細胞凋亡明顯增多，Bcl-2的表達明顯減少，Bax的表達明顯增多，其中糖尿病缺血-再灌注組心肌細胞凋亡比正常大鼠缺血-再灌注組心肌細胞凋亡更為明顯，給予高壓氧預處理后正常及糖尿病大鼠凋亡細胞均明顯減少，Bcl-2的表達明顯增多，Bax的表達明顯減少，與缺血-再灌注組比較有統計學意義。說明高壓氧預處理可減輕正常及糖尿病大鼠心肌細胞的凋亡，對正常及糖尿病大鼠缺血-再灌注心肌細胞均具有保護作用，其中對正常大鼠的保護作用更強。關于高壓氧預處理如何實現其抗細胞凋亡，涉及的信號轉導通路及行高壓氧預處理的最佳療程尚有待進一步研究。

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