參芎化瘀膠囊對大鼠全腦缺血損傷的保護作用

李建民 趙雅寧 張姍姍 陳長香 馬素慧 李淑杏 (華北煤炭醫學院，河北 唐山 063000)

如果β淀粉樣肽(Aβ)表達增加，作用時間延長，就會產生氧化應激損傷、炎癥反應、損傷膽堿能神經系統、誘導神經細胞凋亡等神經毒性作用〔1，2〕。參芎化瘀膠囊是由人參、地鱉蟲、川芎、乳香(制)、沒藥(制)、全蝎、紫河車、龍血竭、五味子、石菖蒲、郁金、桑葚子等多種成分組成的復方制劑，具有養血益氣、化瘀通絡等作用。以往研究表明川芎和郁金提純的單方生物制劑對腦缺血損傷有一定的治療作用〔3，4〕。本研究在大鼠全腦缺血再灌注損傷模型上，應用不同劑量參芎化瘀膠囊進行干預，觀察其對神經功能及Aβ的影響，以探討復方制劑參芎化瘀膠囊對缺血性腦卒中的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 參芎化瘀膠囊主要由人參、地鱉蟲、川芎、乳香(制)、沒藥(制)、全蝎、紫河車、龍血竭、五味子、石菖蒲、郁金、桑椹子等多種中藥成分組成的復方制劑，由華北煤炭醫學院研制，批號:Z20051586。

1.2 動物 雄性SD大鼠40只，購自中國醫學科學院實驗動物研究所，實驗動物使用許可證編號:SCXK(京)2005-0013，體重(270±25)g。隨機分成假手術組，模型組，參芎化瘀膠囊高，低劑量組，每組10只大鼠。

1.3 儀器、試劑 圖像采集及圖像分析系統(美國Bio-Rad生物儀器設備公司);八臂迷宮(淮北正華);Aβ兔多抗(北京中杉金橋生物技術有限公司);TUNEL試劑盒(Santa Cruz公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型制作 采用改良的Pulsineli 4血管阻斷(4-VO)法〔5〕制作SD大鼠全腦缺血模型。動物常規麻醉，頸正中切口，分離雙側頸總動脈，在其下置線備用。枕后部正中切開，暴露雙側第1頸椎橫突翼孔，直視下熱凝其下通過的椎動脈，電凝每次時間約2～4 s，使翼小孔后雙側椎動脈永久閉塞。術后大鼠縫皮回籠，24 h后以無創性微動脈夾夾閉雙側頸總動脈，缺血30 min后松開動脈夾，實行再灌注。缺血及再灌注期間用紅外線測溫儀監測耳內鼓膜溫度，并使之維持在(37±0.2)℃。假手術組分離暴露血管，但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈。參芎化瘀膠囊于術前7 d每日經胃灌注給藥給藥1次(低劑量2.4 g/kg，高劑量4.8 g/kg)，連續給藥7 d，第7天常規麻醉后制作腦缺血再灌注模型，術后繼續給藥2 d。

1.4.2 Aβ免疫組織化學檢測 標本多聚甲醛固定，經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，按試劑盒說明進行Aβ免疫組化染色(SABC法)。DAB顯色，蘇木精復染。利用多媒體彩色病理分析系統計值，取均值。

1.4.3 TUNEL法 標本多聚甲醛固定，經過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，按TUNEL檢測試劑盒進行操作，DAB顯色，蘇木精復染。陽性率的定量分析:每個標本取4張切片，每張切片在海馬隨機選取4個視野，在200倍光鏡下計數陽性細胞。

1.4.4 學習和記憶功能檢測 應用八臂迷宮學習和記憶行為功能檢測，每只動物上下午各測試3次，每次間隔至少30 min，取均值。將大鼠放入迷宮內，記數大鼠5 min內搜索放置在八臂中的四個臂內(1、3、5、7號臂)食物餌的規律:①總錯誤次數，即沙鼠進入沒有餌的臂(包括已吃完和未放餌的臂)的次數;②工作記憶錯誤次數，指沙鼠再次進入開始放有餌的臂;③參考記憶錯誤次數，指沙鼠第1次進入沒有放餌的臂。

1.5 統計學處理 應用SPSS13.0統計分析軟件，數據以表示，進行方差分析。

2 結果

2.1 Aβ免疫組織化學結果 Aβ陽性染色顯棕黃色。假手術組，可見少量Aβ陽性細胞，染色淺淡;與假手術組比較，模型組中，Aβ陽性細胞增多，染色棕黃(P＜0.05);與模型組比較，參芎化瘀膠囊組Aβ性細胞數目明顯增多，染色更加深;且高劑量組更加明顯(P＜0.05)，見圖1、表1。

2.2 海馬區神經細胞凋亡變化 與假手術組比較，模型組中TUNEL陽性細胞顯著增多(P＜0.05);與模型組比參芎化瘀膠囊組中TUNEL陽性細胞減少，高劑量組中更為明顯(P＜0.05)，見圖 2、表 1。

圖1 各組大鼠海馬區Aβ蛋白表達(DAB，×400)

圖2 各組大鼠海馬區凋亡神經細胞(TUNEL，×400)

表1 各組海馬區Aβ表達、凋亡神經細胞數量(，n=10)

表1 各組海馬區Aβ表達、凋亡神經細胞數量(，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.05;與模型組比較 :2)P＜0.05;與低劑量組比較:3)P＜0.05，下表同

18.52±2.21 3.17±2.00模型組 34.38±3.121) 33.45±3.481)低劑量參芎化瘀膠囊組 29.07±2.971)2) 22.58±2.271)2)高劑量參芎化瘀膠囊組 22.85±2.861)3) 17.47±1.841)3)凋亡神經細胞假手術組組別 Aβ

2.3 學習記憶功能評估 與假手術組比，模型組動物連續6測試中總錯誤次數、未進入食物所在臂的錯誤次數和重復進入食物所在臂的錯誤次數總均增加(均P＜0.05)，與模型組比較，參芎化瘀膠囊能顯著減少總錯誤次數和參考記憶錯誤次數(P＜0.05)，但對工作記憶錯誤次數沒有影響(均P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠八臂迷宮測試結果(，n=10)

表2 各組大鼠八臂迷宮測試結果(，n=10)

工作記憶2.54±1.09 2.63±1.01 1.17±0.47模型組 8.84±3.781) 6.28±2.821)3.58±1.261)低劑量參芎化瘀膠囊組5.45±2.541)2)4.28±1.601)2)3.49±1.33高劑量參芎化瘀膠囊組3.12±1.801)3)2.10±1.001)3)錯誤次數假手術組組別 總錯誤次數 參考記憶錯誤次數3.35±1.58

3 討論

神經細胞凋亡是造成缺血性腦卒中神經功能缺失的關鍵因素之一，抑制或減少傷后神經細胞的凋亡已成為缺血性腦卒中救治的關鍵環節。前期研究顯示，對前腦缺血再灌注沙鼠進行缺血預處理，可抑制海馬區神經細胞凋亡，改善動物的認知功能情況〔6〕。王征等〔7〕報道含有三七、當歸、丹參、銀杏葉等成分的腦脈泰可抑制缺血半暗帶區神經細胞凋亡而發揮對腦缺血/再灌注損傷有保護作用。本研究結果說明參芎化瘀膠囊對缺血性腦卒中起到了良好的治療效果。

研究表明缺血損傷后細胞毒性物質增多，使軸漿運輸失衡，導致APP積聚或突變，水解途徑趨向淀粉樣膚生成途徑，致使Aβ在細胞內的異常增多增多Aβ主要表達在缺血梗死區周圍和膽堿能豐富的區域如海馬等腦功能重要區域，并與缺血面積與時程相關〔8，9〕;現已證Aβ具有介導氧化應激損傷、炎癥反應、損傷膽堿能神經系統和神經突觸、誘導神經細胞凋亡等神經毒性〔10〕。本研究結果顯示芎化瘀膠囊是通過有效拮抗Aβ神經毒性作用而改善腦缺血再灌注損傷后神經功能恢復的。

1 Lacor PN，Bunie MC，Furlow PW，et al.A beta oligomer-induced aberrati ons in synapse composition，shape，and density provide a molecular basis for loss of connectivity in Alzheimer's disease〔J〕.Neurosci，2007;27(4):796-807.

2 張曉杰，董海影，孫玉榮，等.大鼠大腦海馬注射β-淀粉樣蛋白對caspase-3蛋白表達的影響及通絡救腦口服液的干預作用〔J〕.中華中醫藥雜，2010;25(10):1678-81.

3 鐘 瑜，張 眾，楊國汗，等.川芎嗪對腦缺血再灌注損傷后細胞間黏附作用的影響〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2003;1(5):257-8.

4 吳曉燕.人參總皂甙對大鼠缺血再灌注后神經元凋亡的保護及作用機制的研究〔J〕.神經疾病與精神衛生，2005;5(5):347-50.

5 徐叔云，卞如鐮，陳 修.藥理實驗方法學〔M〕.北京:人民衛生出版社，2002:1065-6.

6 李建民，趙雅寧，陳長香，等.缺血預處理對沙鼠前腦缺血后學習記憶功能及 HSP70表達的影響〔J〕.第四軍醫大學學報，2009;30(18):1707-9.

7 王 征，方 芳，方云祥，等.腦脈泰對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡和 Akt，bcl-2 Bax和caspase-3表達的影響〔J〕.國際神經病學神經外科學雜志，2009;36(4):303-7.

8 李泰東，陸國輝，崔云燕.缺血再灌注對大鼠海馬神經元淀粉樣蛋白及其蛋白前體表達的影響及人參皂甙Rg的干預〔J〕.中風與神經疾病雜志，2008;25(3):417-20.

9 Van Groen T，Puurunen K，Maki HM，et al.Transformation of diffuse betaamyloid precurs or protein and beta-amyloid deposites to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats〔J〕.Stroke，2005;36(30):1551-6.

10 劉 芬，閆 榮.Aβ1-40對PC12細胞突觸素表達的影響〔J〕.中風與神經疾病雜志，2010;27(9):815-8.