甲珠對(duì)肝纖維化大鼠肝組織α-SMA表達(dá)的影響

付德才 張煒婷 樊麗萍 孫鈺瑋 (牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

肝狀細(xì)胞(HSC)的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是HSC是否激活的重要標(biāo)志物，α-SMA的存在表明肝纖維化時(shí)HSC是激活的HSC，能合成大量ECM，是肝纖維化主要的來(lái)源細(xì)胞。中醫(yī)方藥對(duì)肝纖維化有很好的治療效果，并已展示良好的應(yīng)用前景〔1，2〕。甲珠為穿山甲的鱗片，主歸肝經(jīng)，具有軟堅(jiān)、通絡(luò)、散結(jié)的功效，是歷代醫(yī)家治療癥、瘕、集、聚的常用藥，近年來(lái)被廣泛用于治療肝硬化，取得了較好的臨床效果。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)甲珠抗肝纖維化的基礎(chǔ)及臨床研究。本實(shí)驗(yàn)采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纖維化模型，觀察甲珠對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝細(xì)胞損害及肝纖維化發(fā)生的防治作用，探討甲珠保護(hù)肝組織及抗肝纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及藥物 雄性22月齡Wistar大鼠108只，體質(zhì)量(180±30)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。甲珠(牡丹江中醫(yī)院提供)研細(xì)末，高劑量組為2.0 g/kg(體質(zhì)量)，中劑量組為1.0 g/kg(體質(zhì)量)，低劑量組為0.5 g/kg(體質(zhì)量)。

1.1.2 藥品及試劑 CCl4購(gòu)自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司;秋水仙堿(colchicine)購(gòu)自昆明股份制藥有限公司;單克隆即用型鼠抗人α-SMA購(gòu)自北京中山生物試劑公司。Trizol購(gòu)于DingGuo公司，DEPC購(gòu)于 Sigma公司，dNTPs購(gòu)于日本Takara，PCR引物購(gòu)于上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 參照文獻(xiàn)〔3〕方法，實(shí)驗(yàn)第1天除正常對(duì)照組(簡(jiǎn)稱對(duì)照組)外，其余動(dòng)物予CCl4分析純5 ml/kg體重，以后每隔3 d注射400 ml/L CCl4橄欖油劑3 ml/kg體重，連續(xù)8 w，實(shí)驗(yàn)前2 w飼喂高脂玉米粉飼料(795 g/kg玉米粉 +200 g/kg豬油 +5 g/kg膽固醇)，第 3～6周飼喂玉米粉1 000 g/kg和乙醇飲料300 ml/L。

1.2.2 分組及給藥方法 采用成組設(shè)計(jì)，將108只大鼠隨機(jī)分為6組，每組18只，第1組正常對(duì)照組，飼喂正常飲食;第2組模型組，按上述造模方法給予飲食;第3組秋水仙堿組，于造模第3周開(kāi)始給予秋水仙堿0.1 mg·kg－1·d－1;第4組甲珠高劑量組，于造模第3周開(kāi)始給予甲珠混懸液灌胃，2.0 g·kg－1·d－1;第5組甲珠中劑量組，于造模第3周開(kāi)始給予甲珠混懸液灌胃，1.0 g·kg－1·d－1;第6組甲珠高劑量組于造模第3周開(kāi)始，給予甲珠混懸液灌胃，0.5 g·kg－1·d－1，共8 w，造模結(jié)束時(shí)模型組死亡3只，中劑量組死亡3只，低劑量組死亡2只，秋水仙堿組死亡2只，高劑量組死亡1只，為增加可比性，每組均采用15只。

1.2.3 標(biāo)本制作 上述造模及處理過(guò)程結(jié)束日，禁食12 h后稱質(zhì)量，股靜脈取血，分離血清置－20℃保存;并立刻完整摘取肝臟及脾臟，稱質(zhì)量后用生理鹽水漂洗肝左葉數(shù)次，濾紙拭干后，切取0.2 g置于冰浴中的組織勻漿器內(nèi)，加入冰生理鹽水2 ml，制備成100 g/L肝組織勻漿，4 000 r/min 4℃離心，取上清液保存于－20℃。肝右葉置于40 g/L中性甲醛液中常規(guī)固定，石蠟包埋，用于制作組織芯片。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 病理檢測(cè) 組織芯片分別行常規(guī)HE染色、Masson三色染色(染膠原纖維)及網(wǎng)織纖維染色，光鏡下觀察，根據(jù)王泰齡等改進(jìn)的肝纖維化半定量評(píng)分系統(tǒng)(SSS)〔4〕進(jìn)行炎癥活動(dòng)度及肝纖維化程度計(jì)分。

1.3.2 免疫組化SP法檢測(cè)肝組織α-SMA含量 取肝左葉放入10%中性磷酸甲醛液中固定，取肝左葉最大橫截面石蠟包埋切片，進(jìn)行α-SMA免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色步驟:石蠟切片脫蠟、水化后，PBS沖洗3次，每次3 min;對(duì)組織進(jìn)行微波修復(fù);PBS沖洗3次，每次3 min;加試劑A過(guò)氧化酶阻斷溶液，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min;PBS沖洗3次，每次3 min;加試劑B正常山羊血清封閉，室溫下孵育10 min;甩去血清，加相應(yīng)的一抗1∶100稀釋，4℃過(guò)夜;PBS沖洗3次，每次3 min;加試劑C生物素標(biāo)記的第二抗體1∶60稀釋，室溫下孵育25 min;PBS沖洗3次，每次3 min:加試劑D鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫下孵育25 min;PBS沖洗3次，每次3 min;加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯二胺鹽酸鹽(DAB)溶液顯色;自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，分化返藍(lán)，切片經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

在全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)上，采用HPIAS-2000型圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選取每張切片10個(gè)視野(×200)測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值與所占視野面積，灰度值在0～249之間，灰度值越高，染色越淺，表達(dá)產(chǎn)物越少;灰度值越低，染色越深，表達(dá)產(chǎn)物越多。

1.3.3 RT-PCR法檢測(cè)肝組織α-SMA mRNA 大鼠GAPDH上游引物:5'-CATGGTCTACACGTTCCAGT-3'，下游引物:5'-CATTGAGAGCAATGCCAGCT-3'，全長(zhǎng) 785 bp;TGFβ1上游引物:5'-ACTACTGCTTCAGCTCCACA-3'，下游引物:5'-ATCATGTTGGACAACTGCTC-3'，全長(zhǎng) 301 bp;α-SMA 上游引物:5'-TGTGCTGGACTCTGGAGATG-3'，下游引物:5'-CTTCTGCATCCTGTCAGCAA-3'，全長(zhǎng) 493 bp。

大鼠肝組織總RNA的提取按Trizol試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。①?gòu)囊旱拗腥〕?00 mg肝組織放入冰浴的研磨器內(nèi)，加入1 ml Trizol，使用電動(dòng)勻漿機(jī)充分研磨，直到液體不再黏稠;②將裂解物移到2 ml離心管內(nèi)，室溫放置5～10 min;③加入0.2 ml氯仿，震蕩混勻 15 s，室溫放置10 min;④12 000 r/min，4℃離心10 min;⑤取上層水相，加0.5 ml異丙醇混勻，室溫放置10 min;⑥12 000 r/min，4℃離心10 min;⑦棄上清，加 1 ml 75%乙醇，不要混勻，7 500 r/min，4℃離心5 min;⑧棄上清，室溫晾干5～10 min，不要完全干燥;⑨用10 μl/1 000 DEPC處理水溶解;⑩取2 μl稀釋后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)濃度。

在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定核酸260 nm和280 nm的吸收值，判斷RNA質(zhì)量和濃度。如OD260/OD280＞1.8，證明純度較高。核酸濃度的計(jì)算:RNA的濃度(μg/ml)=40×稀釋倍數(shù)×OD260值。

1.3.4 RT-PCR 肝組織總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)量，每個(gè)樣本取5 μg RNA在 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成 cDNA，即42℃水浴60 min，95℃水浴5 min滅活A(yù)MV。PCR反應(yīng)體系為100 μl，反應(yīng)條件:94℃變性30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min，同法擴(kuò)增GAPDH作為內(nèi)參照。取5 μl PCR產(chǎn)物150 ml/L瓊脂糖凝膠電泳 30 min(100 V)，用圖像分析儀掃描底片上PCR產(chǎn)物帶，以內(nèi)參GAPDH為基準(zhǔn)，作半定量，即以目的基因擴(kuò)增量/GAPDH擴(kuò)增量表示所擴(kuò)增目的基因片段的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 α-SMA在胞質(zhì)表達(dá)，正常對(duì)照組只表達(dá)于小動(dòng)脈及小靜脈，在膽管無(wú)表達(dá)。模型組α-SMA主要表達(dá)于匯管區(qū)及纖維間隔，且呈長(zhǎng)橢圓形或梭形。模型組α-SMA免疫組織化學(xué)染色灰度值明顯降低，表達(dá)產(chǎn)物增加，陽(yáng)性染色程度增加，顯著高于正常組(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)表明不同劑量甲珠與秋水仙堿灌胃防治后，較模型組α-SMA灰度值升高，表達(dá)產(chǎn)物減少，陽(yáng)性染色程度不同程度減輕(P＜0.01);模型組α-SMA免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性面積明顯升高，顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。甲珠治療各組及秋水仙堿干預(yù)組染色陽(yáng)性面積明顯低于模型組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 RT-PCR結(jié)果 正常肝組織不表達(dá)α-SMA mRNA，模型組較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng);不同劑量甲珠(2.0、1.0、0.5 g/kg)與秋水仙堿(0.1 mg/kg)灌胃組α-SMA mRNA表達(dá)明顯減少，與模型組比較差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

2.3 大鼠肝組織病理變化

2.3.1 HE染色 正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細(xì)胞大小、形態(tài)一致。模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，肝細(xì)胞彌漫性水樣變性和脂肪變性，肝竇及中央靜脈明顯擴(kuò)張，肝索排列紊亂，門管區(qū)及肝小葉內(nèi)可見(jiàn)明顯的灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)間質(zhì)細(xì)胞大量彌漫性增生，分隔包繞肝細(xì)胞，部分區(qū)域形成細(xì)胞纖維間隔，或纖維細(xì)胞間隔，纖維組織增生明顯，將肝小葉分隔成大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)，假小葉形成。甲珠干預(yù)各組肝細(xì)胞有不同程度的變性壞死，匯管區(qū)及小葉間有少量纖維組織增生，纖維間隔細(xì)小，肝細(xì)胞索排列較整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組減輕，與模型組比較纖維化程度差異顯著。秋水仙堿干預(yù)組肝細(xì)胞有不同程度的變性壞死，匯管區(qū)及小葉間有少量纖維組織增生，肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂肪沉積。

表1 各組大鼠肝組織α-SMA的染色灰度值及染色陽(yáng)性面積(n=15，)

表1 各組大鼠肝組織α-SMA的染色灰度值及染色陽(yáng)性面積(n=15，)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 α-SMA灰度值 α-SMA陽(yáng)性面積(%)正常對(duì)照組14.23±1.41 116.44±12.60 1.48 ±0.24模型組 79.518±9.811) 16.32±1.751)秋水仙堿組 103.74±17.692) 9.45±1.27甲珠高劑量組 109.18±17.542) 9.21±1.29甲珠中劑量組 100.7±13.092) 12.63±1.44甲珠低劑量組 98.70±9.792)

表2 各組大鼠肝組織α-SMA mRNA/GAPDH mRNA比較(n=15，，%)

表2 各組大鼠肝組織α-SMA mRNA/GAPDH mRNA比較(n=15，，%)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

-SMAmRNA/GAPDH正常對(duì)照組組別 α 14.23±1.57 1.48±0.24模型組 16.32±2.141)秋水仙堿組 9.46±1.202)甲珠高劑量組 9.21±1.122)甲珠中劑量組 12.63±2.422)甲珠低劑量組

圖1 肝纖維化大鼠肝組織α-SMA mRNA RT-PCR凝膠電泳結(jié)果

2.3.2 大鼠肝組織Masson三重膠原染色 Masson三重膠原染色可見(jiàn):正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列規(guī)則，小葉周邊僅見(jiàn)少量膠原纖維呈綠色，染色較輕。模型組大鼠肝組織膠原纖維明顯增生，沿匯管區(qū)或炎癥壞死區(qū)向外延伸，形成厚薄不一的纖維間隔，分割包繞肝小葉，局部有假小葉形成。甲珠干預(yù)各組肝組織也有少量綠色的膠原纖維增生，主要分布于肝臟間質(zhì)內(nèi)，部分向肝小葉內(nèi)伸展，且膠原纖維較纖細(xì)，部分區(qū)域可見(jiàn)膠原纖維沿炎癥壞死區(qū)延伸，形成間斷、薄的纖維間隔，無(wú)明顯假小葉形成。秋水仙堿組介于治療組和模型組之間。Masson膠原染色定量分析結(jié)果表明，模型組膠原顯色指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，甲珠高劑量組、中劑量組和秋水仙堿組膠原顯色指數(shù)顯著低于模型組(P＜0.01)，甲珠低劑量組膠原顯色指數(shù)明顯低于模型組(P＜0.05)。

3 討論

Hyp是構(gòu)成膠原纖維的特異氨基酸成分，肝組織Hyp的含量可較準(zhǔn)確地反映肝組織膠原纖維含量。在肝纖維化實(shí)驗(yàn)研究中，常以此指標(biāo)來(lái)反映膠原纖維增生的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCl4誘發(fā)大鼠肝纖維化后肝組織Hyp顯著升高，與正常組形成顯著差異，說(shuō)明膠原增生十分活躍，與以往報(bào)道結(jié)果相符。經(jīng)甲珠各組治療后其含量明顯降低，其中高劑量組尤為明顯。表明甲珠對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化程度具有較好的防治作用。

研究表明脂質(zhì)過(guò)氧化是肝纖維化發(fā)生途徑中的重要環(huán)節(jié)之一。機(jī)體受到外界環(huán)境的氧化損傷后產(chǎn)生大量自由基攻擊細(xì)胞膜導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，使肝細(xì)胞損傷和壞死，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成。在CCl4誘發(fā)的肝纖維化發(fā)生機(jī)制中，自由基的肝損傷作用尤為突出。氧自由基可促使不飽和脂肪自由基形成，脂質(zhì)自由基可引起細(xì)胞膜的流動(dòng)性、通透性和完整性的破壞，進(jìn)而使其雙層結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂，引起膜鑲嵌的一系列酶的排列紊亂、功能喪失，細(xì)胞的能量產(chǎn)生系統(tǒng)癱瘓。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死，其含量反映了組織過(guò)氧化的損傷程度〔5～8〕。SOD的變化可以間接地反映疾病情況下自由基的變化。SOD為高效的清道夫，可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整的作用〔9〕。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化是引起肝細(xì)胞損傷和HSCs活化的重要機(jī)制〔10〕，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有氧自由基的產(chǎn)生，隨后的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(如MDA)可通過(guò)JUK通路激活HSCs I型膠原α2基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。在多種肝纖維化模型中均發(fā)現(xiàn)肝臟MDA含量升高及GSH水平降低〔11，12〕。甲珠治療后能明顯降低肝組織中Hyp、MDA含量，提高SOD的水平，從而增強(qiáng)肝臟清除自由基的能力，減少肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，進(jìn)而減少ECM的形成，減輕肝細(xì)胞損傷，發(fā)揮其保護(hù)肝臟和抗肝纖維化的作用。

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