醛固酮對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)纖溶酶原激活物抑制物-1和纖維連接蛋白的影響

孫東立 李曉東 (唐山市工人醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 唐山 063000)

腎間質(zhì)纖維化是各種原因所致慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同途徑〔1〕。腎間質(zhì)纖維化的本質(zhì)就是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的異常沉積，而ECM過(guò)度合成和降解受抑制是ECM積聚的直接原因〔2〕。最近研究表明，醛固酮(aldosterone，ALD)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用〔3〕，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)致纖維化的細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)等〔4，5〕。但ALD是否通過(guò)調(diào)節(jié)ECM的合成和降解導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，目前尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)觀察ALD對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的影響，以探討ALD在腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人近端腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞中心(來(lái)源于美國(guó)ATCC)。D-ALD(美國(guó)Sigma)，Trizol試劑(美國(guó) Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó) Promega)，F(xiàn)N ELISA試劑盒(武漢博士德)，胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù) HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于含5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中，實(shí)驗(yàn)前用無(wú)血清培養(yǎng)液同步化24 h。參照文獻(xiàn)〔6〕及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別加入終濃度為 0、10－11、10－10、10－9、10－8mol/L ALD 含 5%FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)液刺激HK-2細(xì)胞48 h。

1.3 半定量RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中PAI-1和FN mRNA的表達(dá) Trizol提取細(xì)胞總RNA，瓊脂糖電泳鑒定RNA完整性，測(cè)定A260/A280均＞1.8。取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。應(yīng)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，PAI-1(431 bp):正義5'-GTA TCT CAG GAA GTC CAG CC-3'，反義 5'-TCT AAG GTA GTT GAA TCC GAG C-3';FN(639 bp):正義5'-CGAAATCACAGCCAGTAG-3'，反義 5'-ATC ACA TCC ACA CGG TAG-3';β-actin(202 bp):正義5'-CCT TCC TGG GCA TGG AGT CCT G-3'，反義5'-GGA GCA ATG ATC TTG ATC TTC-3'。引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)條件為:94℃變性5 min;然后94℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán);再于72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中掃描成像、分析電泳條帶灰度值。計(jì)算目的基因與內(nèi)參β-actin灰度值的比值，即得目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FN的含量 收集細(xì)胞上清液，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中FN的含量，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，兩均數(shù)比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ALD對(duì)HK-2細(xì)胞中PAI-1和FN mRNA表達(dá)的影響 半定量RT-PCR結(jié)果顯示，正常HK-2細(xì)胞中有少量PAI-1和FN基因表達(dá)，不同濃度的ALD刺激HK-2細(xì)胞48 h后，其表達(dá)量與對(duì)照組比較均明顯增加，且呈一定的劑量依賴性(P＜0.05)。見圖1。

圖1 ALD對(duì)HK-2細(xì)胞中PAI-1和FN mRNA表達(dá)的影響

2.2 ALD對(duì)HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FN含量的影響 正常HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有一定含量的 FN〔(96.7±10.5)ng/ml〕，10－11、10－10、10－9、10－8mol/L 濃度的 ALD 刺激細(xì)胞48 h后，培養(yǎng)上清液中FN的含量分別為(126.0±12.3)、(135.3±17.6)、(148.4 ±14.4)、(161.2 ±15.1)ng/ml，均明顯增加，且具有一定的劑量依賴性(P＜0.05)。

3 討論

在腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程中，ECM并不是靜止不動(dòng)的，而是處在不斷代謝更新、降解重塑的動(dòng)態(tài)平衡中〔7〕。ECM合成增加和降解減少是ECM過(guò)度積聚的直接原因。PAI-1是纖溶酶原激活物最重要的抑制劑，許多腎臟疾病(如腎小球腎炎、新月體性腎炎、IgA腎病、狼瘡性腎炎等)腎組織局部PAI-1表達(dá)上調(diào)，PAI-1的變化在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用〔8〕。TGF-β1、CTGF、腫瘤壞死因子-α、表皮生長(zhǎng)因子等對(duì)PAI-1均具有上調(diào)作用〔9～11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALD呈劑量依賴性地促進(jìn)HK-2細(xì)胞PAI-1的基因表達(dá)。PAI-1的表達(dá)增加將抑制纖溶酶原激活物t-PA和u-PA的生物學(xué)功能，使纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶減少，引起ECM降解障礙，導(dǎo)致ECM合成和降解失衡，ECM過(guò)度積聚，從而在腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程中發(fā)揮作用。

腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中，沉積在腎間質(zhì)的ECM成分主要有FN和膠原等。FN是這一過(guò)程中首先出現(xiàn)的ECM，起支架作用，對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞遷移、黏附及其他ECM成分的沉積起重要作用，其變化顯示了ECM質(zhì)和量的改變〔12〕。本實(shí)驗(yàn)從基因和蛋白質(zhì)兩個(gè)水平研究ALD對(duì)HK-2細(xì)胞表達(dá)FN的影響，結(jié)果顯示，ALD呈劑量依賴性地促進(jìn)HK-2細(xì)胞合成和分泌FN，從而促進(jìn)腎間質(zhì)ECM積聚，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

因此，ALD可能通過(guò)促進(jìn)HK-2細(xì)胞ECM的合成，并上調(diào)PAI-1的表達(dá)，抑制ECM降解，兩種機(jī)制共同作用促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。拮抗ALD對(duì)HK-2細(xì)胞的作用可能成為防治腎間質(zhì)纖維化的新途徑。

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