萎縮性胃炎大鼠p16，bcl-2，PCNA的表達及葉酸的預防作用

陳海金 王惠吉 (福建醫科大學附屬協和醫院急診科，福建 福州 35000)

慢性萎縮性胃炎與胃癌關系密切。胃黏膜發生惡性變的過程中，不僅存在細胞增殖的異常，同時細胞凋亡機制的異常也發揮了重要作用。葉酸已被應用于預防肝癌和結腸癌等多種腫瘤，逆轉癌前病變，但關于葉酸對胃黏膜萎縮的預防及治療研究很少。隨著人體年齡的增長，胃黏膜組織發生退行性萎縮非常普遍，老年群體對疾病反應不敏感，一旦檢出胃癌已進入進展癌，甚至晚期癌。因此從病理檢查及分子生物學對萎縮性胃炎進行研究十分必要，本文探討萎縮性胃炎的細胞增殖調控改變及葉酸對其預防作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和制模方法 健康雄性清潔級SD大鼠，鼠齡7 w，體重210～240 g，共40只，隨機分成對照組10只，模型組及葉酸預防組各15只，對照組自由進食及進水，參照文獻〔1〕，造模組采用三種損傷因素聯合作用，0.1%氨水自由飲用(氨水每天新鮮配制)，20 mmol/L脫氧膽酸鈉8 ml/kg每天灌胃，60%酒精8 ml/kg每三天空腹灌胃一次(前一天晚上撤除飼料)。葉酸預防組造模同時，以 0.5 mg/ml葉酸溶液5 mg·kg－1·d－1灌胃，共6個月。動物每周測量體重，根據體重變化調整藥物劑量。

1.2 藥品及試劑 氨水:由北京化工廠生產，25% ～28%，分析純，批號:20041102;乙醇:由北京化工廠生產，95%，分析純，批號:20050104;脫氧膽酸鈉:SERVA進口分裝，滬試，批號:F20031018;葉酸:天津飛鷹制藥有限公司，5 mg/片，批號:20050210;葉酸試劑盒:美國BECKMAN COULTER公司;PCNA免疫組化試劑:兔多克隆抗體，1∶100稀釋，Santa Cruz，sc-7907;p16免疫組化試劑:小鼠單克隆抗體，1∶100稀釋，Santa Cruz，sc-1661;bcl-2免疫組化試劑:1∶80稀釋，DAKO，H712430;二抗:Envision試劑(為即用型試劑，購自Dako公司)。

1.3 標本制作及指標檢測

1.3.1 標本制備 動物處死前禁食24 h，將大鼠以50 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，沿正中線剪開腹腔及胸腔，以10 ml注射器刺入心臟取血，后取出全胃，沿胃大彎剪開，于冰鹽水中沖洗干凈。取病理標本后，胃黏膜吸去水分，刮取胃黏膜，用電子天平稱重，盡快放入含0.2 mol/L醋酸的勻漿器中，醋酸的量按100 μg胃黏膜組織加100 μl計算，輕輕碾磨，制成勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，取血后靜置2 h后3 000 r/min離心15 min，取上清液，－20℃以下冰箱保存，試驗結束后統一檢測。病理標本沿胃小彎及大彎縱行取材，包括前胃，腺胃，十二指腸全長，寬約4 mm，置入10%中性甲醛溶液，固定8～24 h，經全自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片，行HE染色觀察胃黏膜萎縮情況。

1.3.2 葉酸檢測 由化學發光儀自動檢測，濃度過高則適度稀釋重測。

1.3.3 病理組織學觀察 萎縮性胃炎分級按照悉尼分級系統進行，即腺體減少1/3位輕度萎縮，減少在1/3～2/3之間中度萎縮，減少2/3以上為重度萎縮。

1.3.4 PCNA，p16，bcl-2蛋白檢測 免疫組化法檢測PCNA、p16、bcl-2在胃黏膜的表達。用已知陽性標本作陽性對照。用PBS代替一抗，結果應為陰性。陽性為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀，背景呈紫藍色。p16及bcl-2陽性細胞在5%以下為陰性，5%以上為陽性。光鏡下觀察PCNA染色切片5個具有代表性的高倍視野，分別計數200個細胞，共計1 000個細胞，計算出PCNA陽性細胞百分比即增殖指數(PI)。

1.4 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件進行數據的統計分析，結果以表示。計量資料先進行數據的正態性檢驗、方差齊性檢驗，符合上述條件的進行方差分析，否則作秩和檢驗。計數資料行χ2檢驗。

2 結果

2.1 動物一般情況 正常對照組大鼠被毛緊密貼身，色白光澤，兩眼有神，活動敏捷，食量較多，隨體重增加而增加，后期食量穩定，大便呈顆粒狀，尾色淡紅;模型組大鼠被毛松散蓬亂，毛色偏黃無光澤，眼瞇無神，活動少而遲鈍，拱背，喜扎堆，形體瘦小，食量下降，多數大鼠出現便溏及拉尾現象，尾色淡白或蒼白，3組大鼠體重均呈上升增長趨勢，但模型組大鼠體重增加緩慢，至8 w時，已顯著低于對照組(P＜0.01)，葉酸預防組各時間段體重均高于模型組(P＜0.01)，第18周起體重甚至有所下降，死亡增多。試驗結束時模型組共死亡3只，葉酸預防組死亡4只，對照組沒有自然死亡，見表1。

表1 各組大鼠試驗過程中體重變化(，g)

表1 各組大鼠試驗過程中體重變化(，g)

與同期對照組比較:1)P＜0.01

__組別 0月 第2月 第4月 第6月對照組 239.66±6.06 469.88±30.95 567.63±33.01 654.17±43.9(n) (10) (10) (10) (10)模型組 234.34±7.27 351.68±47.901)432.74±54.471)381.92±47.261)(n) (15) (15) (14) (12)葉酸組 236.47±6.52 362±41.26 456±47.94 477±43.29__(n)__________(15)________________________________________________(14)__(13)(11)

2.2 病理組織學觀察

2.2.1 肉眼觀察 正常對照組胃黏膜色澤淡紅，表面光滑，無顆粒感，附有較多黏液，黏膜皺襞完整，厚薄適中。造模組可見:大部分大鼠出現胃腸脹氣，胃黏膜有充血、糜爛、潰瘍等病變，胃黏膜色紫暗，表面黏液較少，表面粗糙有顆粒，皺襞減少但粗大，胃黏膜變薄，并可見黏膜下血管，見圖1。

圖1 大鼠胃黏膜大體觀

2.2.2 光鏡觀察 正常大鼠胃黏膜內偶可見少量淋巴細胞及嗜酸細胞，胃竇小凹和腺體厚度約1∶1，腺體排列整齊，模型大鼠胃竇黏膜有大量淋巴細胞浸潤及少量中性粒細胞，部分有成堆淋巴細胞聚集灶，腺體有不同程度的排列紊亂，稀疏，胃小凹變寬，稀疏，腺體層變薄腺體部纖維結締組織增生，黏膜肌層增厚，向黏膜固有層伸展呈分支狀插入腺體之間。根據萎縮性胃炎診斷標準，造模組基本達到中度萎縮性胃炎，少數為輕度或重度萎縮性胃炎。葉酸預防組與對照組比較病變仍然明顯腺體變薄及腺體減少，但胃體壁細胞與對照組比較無統計學差異(P＞0.05)，胃竇黏膜腺體厚度及腺體數目與模型組比較有所改善，病變相對不嚴重，腺體數目與模型組比較有統計學差異(P＜0.05)。定性診斷發現葉酸預防組有減輕趨勢，但無統計學差異見(P ＞0.05)，見表2、表3，圖2。

2.3 血清及胃黏膜組織葉酸水平 模型組大鼠血清及胃黏膜組織中葉酸與對照組比較有所降低，但無統計學差異(P＞0.05)。葉酸預防組血清及胃黏膜組織葉酸較造模組及正常組明顯上升(P＜0.05)，見表4。

表2 各組胃黏膜萎縮定性結果

表3 各組胃黏膜病理計量結果()

表3 各組胃黏膜病理計量結果()

與對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 對照組(10) 模型組(12) 葉酸預防組(11)64.09±19.54胃竇腺體數目 67.38±4.66 35.67±7.751) 46.64±12.622)胃體大彎腺體厚度(μm)450.50±46.29 437.25±60.00 446.27±53.06胃體小彎腺體厚度(μm)360.38±44.00 327.83±41.33 332.28±39.79胃體壁細胞數 177.25±31.51 129.08±30.211)149.91±29.462)胃竇厚度(μm) 102.38±14.65 52.25±19.341)

表4 血清及胃黏膜組織葉酸水平()

表4 血清及胃黏膜組織葉酸水平()

與模型組比較:1)P＜0.01

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圖2 大鼠胃竇黏膜(×40)

2.4 胃黏膜PCNA，p16，bcl-2表達情況 PCNA主要表達于細胞核，在對照組大鼠胃黏膜中呈帶狀分布，主要位于腺體頸部，上皮及腺體底部表達很少。模型組大鼠胃黏膜PCNA表達較對照組明顯增加(P＜0.01)。bcl-2表達于細胞質，在正常胃黏膜低表達，在模型組表達陽性面積增加，較對照組增加(P＜0.01)。p16陽性表達主要位于細胞核，在對照組大鼠高表達，模型組表達陽性面積較對照組有明顯降低(P＜0.01)。葉酸預防組較模型組PCNA和bcl-2表達均明顯下調(P＜0.05)，但PCNA在葉酸預防組仍比對照組明顯增高(P＜0.05)，而p16蛋白兩組之間無差異(P＞0.05)，見表5～表7，圖3～圖5。

表5 PCNA在各組中的表達

表6 bcl-2在各組中的表達

表7 p16蛋白在各組中的的表達

圖3 p16蛋白在大鼠胃黏膜的表達(×100)

圖4 bcl-2蛋白在大鼠胃黏膜的表達(×100)

圖5 PCNA在大鼠胃竇黏膜的表達(×100)

3 討論

目前認為，凡引起胃竇炎的因素持續存在或再生不良是導致萎縮性胃炎的病因。本實驗萎縮性胃炎表現，與人類萎縮性胃炎極為相似。

PCNA對DNA復制起重要作用，可較好地反映細胞增殖狀態。研究證實，萎縮性胃炎組織中細胞凋亡是明顯增加的〔2〕。為了保持胃黏膜細胞總量，過量的細胞凋亡會誘發代償性細胞增殖，如果損傷因素持續存在，胃黏膜持續增殖旺盛，將增加DNA自發復制錯誤的機會，也增加了外來因素對DNA損傷的機會，為細胞癌變提供有利的條件。bcl-2表達與腸型胃癌觸發有關，而與其進展無關。p16蛋白表達低下是胃癌發生過程中的早期事件之一〔3〕。我們在大鼠實驗性萎縮性胃炎中未觀察到p16蛋白表達明顯缺失，但存在蛋白表達程度的減少，同時我們發現其蛋白表達與PCNA蛋白表達呈負相關。本實驗中，大鼠出現單純萎縮性胃炎，雖未見明顯腸上皮化生和異型增生，其bcl-2表達率為62.5%。我們在大鼠萎縮性胃炎中觀察到凋亡抑制基因表達增加，這可能對細胞凋亡有所抑制，如果細胞增殖不減弱或增加，細胞增殖和細胞凋亡的平衡被打破，將有發展成胃癌的危險。

萎縮性胃炎作為一種癌前狀態，有發展成腸型胃癌的可能，所以應積極預防。目前，葉酸已被應用于預防肝癌和結腸癌等多種腫瘤，逆轉癌前病變。胃癌及癌前狀態往往存在胃黏膜細胞內葉酸水平低下〔4〕，葉酸可以在一定程度上預防腫瘤的發生，其機制與維持DNA甲基化水平〔5〕，抑制鳥氨酸脫羧酶和酪氨酸激酶的活性〔6〕，和影響凋亡的發生〔7〕有關。我們選用葉酸對大鼠致萎縮的同時進行治療發現，葉酸可以提高血清及為黏膜中葉酸水平，在一定程度上減輕胃黏膜組織學改變，但未達到完全逆轉，葉酸能否預防萎縮性胃炎的發生，需要更長時間的觀察。葉酸治療后PCNA表達雖然與模型組比較雖然有所減少，但與對照組比較仍然很高，另外，葉酸可抑制bcl-2蛋白的表達水平，這在防止胃黏膜細胞惡性增殖可能有一定作用，使細胞增殖處于適度范圍內。葉酸治療后減少bcl-2蛋白表達升高及p16蛋白表達下降是否與葉酸維持DNA甲基化狀態有關，以及是否尚有其他機制參與，有待進一步研究。

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3 董西林，董 蕾，柴寧利，等.十二指腸胃反流模型大鼠胃黏膜組織CyclinD1、p16蛋白表達醫學臨床研究〔J〕.2004;21(5):467-71.

4 Farinati F，Cardin R，Russo VM，et al.Helicobacter pylori cagA status，mucosal oxidative damage and gastritis phenotype:a potential pathway to cancer〔J〕.Helicobacter，2003;8(3):227-34.

5 Kodama K，Sumii K，Kawano M，et al.Gastric juice nitrite and vitamin C in patients with gastric cancer and atrophic gastritis:is low acidity solely responsible for cancer risk〔J〕.Eur J Gastroenterol Hepatol，2003;15(9):987-93.

6 Kapadia CR.Gastric atrophy，metaplasia，and dysplasia:a clinical per-spective〔J〕.J Clin Gastroenterol，2003;36(5 suppl):S29-36.

7 劉正新，陳寶雯，楊桂彬，等.不同胃黏膜病變的細胞增殖變化規律及其意義〔J〕.中華內科雜志，2004;8(43):580-3.