咪喹莫特對哮喘小鼠Toll樣受體7及IL-12、IL-13水平的影響

陳苗苗 李志潔 (鄭州大學第二附屬醫院兒科，河南 鄭州 450014)

支氣管哮喘是一種由多種細胞(嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞及氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，其病理特點是嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤，黏液分泌增多和氣道狹窄等。哮喘的機制十分復雜，其中Th1與Th2平衡失調是哮喘的重要發病機制。近年研究發現，Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是一類I型跨膜蛋白介導的天然免疫模式識別受體，其中TLR7是其中的重要成員之一。M¨oller-Larsen等〔1〕研究發現TLR7基因與哮喘密切相關，TLR7能特異性識別人工合成的小分子免疫調節劑咪喹莫特，識別后能上調其表達并能進一步誘導Th1類細胞因子IL-12、抑制Th2類細胞因子IL-13的產生，以維持機體免疫功能的平衡。本文以哮喘小鼠為動物模型，利用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定肺組織中TLR7 mRNA的表達水平，并測定肺泡灌洗液中IL-12和IL-13的濃度，旨在探討咪喹莫特治療哮喘的主要作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 4周齡清潔級雌性BALB/C純系小鼠30只，體重15～20 g，購自鄭州大學實驗動物中心。

1.1.2 設備與制劑 咪喹莫特(上海特化醫藥有限公司)，雞卵白蛋白(OVA，美國Sigma公司)，小鼠IL-12和IL-13 ELISA試劑盒(美國R＆D公司)。小鼠TLR7引物序列，上游:cctcaaggctcagaagat，下游:cccactaacaccaccaat。Trizol、逆轉錄試劑盒、dNTP、Taq DNA聚合酶、Trans DNA Marker I(北京全式金生物有限公司)，引物(北京三博遠志生物技術有限責任公司)，低溫冰箱(SANYO公司)，低溫離心機(Sigma公司)，無菌操作臺(蘇州凈化設備有限公司)，酶標儀(Multiskan MK3，Thermo Labsystems公司)，PCR儀(珠海黑馬醫學儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與模型建立 SPF級雌性BALB/C系小鼠30只隨機分成3組，每組10只。B組(哮喘模型組):小鼠腹腔注射0.1 ml OVA致敏液(含OVA 100 μg和氫氧化鋁凝膠400 μg)，再以相同的劑量和方法在第7天和第14天各致敏一次，21 d后以10 g/L OVA溶液超聲霧化激發，每天30 min，持續7 d。C組(咪喹莫特組):在哮喘組的基礎上，在霧化吸入OVA溶液前1 h預先吸入1.5 g/L咪喹莫特混懸液30 min，連續7 d。A組(正常對照組):第0、7、14天給予小鼠腹腔注射生理鹽水0.1 ml，21 d后以生理鹽水溶液超聲霧化激發，每天30 min，持續 7 d。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗(BAL)及支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞分離與計數 在末次激發后24 h，各組小鼠予以100 g/L水合氯醛溶液400 mg/kg腹腔注射麻醉，立即打開胸腔，在環狀軟骨上用血管鉗將氣管固定并在其下作一個橫行切口，置入連接注射器的硅膠管，每次緩慢注入生理鹽水0.4 ml，分3次注入，每次灌洗完后立即回收置于高壓滅菌過的EP管中，計量，并放于 －4℃冰箱儲存，2 h內作細胞分離。BALF于2 000 r/min離心20 min，細胞沉淀用0.5 ml PBS液重懸，取0.1 ml在血細胞技術臺測定細胞總數;取0.2 ml進行涂片，Wright-Giemsa染色，計數大于200個細胞作細胞分類計數。

1.2.3 三組小鼠BALF中IL-12、IL-13水平檢測 采用小鼠IL-12、IL-13 ELISA檢測試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作，根據吸光度值計算出標本中所含各因子的含量。

1.2.4 小鼠肺組織病理改變 三組小鼠在末次激發后24 h，立即打開胸腔，取出左上葉肺組織，用4%中性多聚甲醛固定20 h，石蠟切片后HE染色，顯微鏡下觀察肺組織的炎癥變化。

1.2.5 小鼠肺組織TLR7 mRNA表達水平的檢測 三組小鼠在末次激發后24 h，立即打開胸腔，取出右上葉肺組織，凍存，－80℃保存，待提取總RNA進行RT-PCR。小鼠肺組織RNA提取按Trizol說明書進行操作，RT-PCR條件如下:42℃ RT 30 min，85℃加熱5 min。終止RT反應的同時進行擴增預變性，94℃預變性2 min，1 個循環;94℃變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸2 min，共35個循環;72℃延伸6 min。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上，在10 V/cm電壓下電泳30 min，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用D-140圖像記錄分析系統進行分析，計算目的基因和β-actin的DNA條帶灰度值比值。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5統計學軟件，計量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，數據間兩兩比較用q檢驗。

2 結果

2.1 HE染色及光鏡觀察肺組織病理改變 正常對照組小鼠氣道上皮平整，肺泡腔內未見炎性滲出，黏膜下也未見炎癥細胞浸潤，氣管平滑肌無增厚。哮喘模型組小鼠細支氣管的管壁增厚，平滑肌增生，可見上皮細胞脫落、排列紊亂，周圍組織水腫，血管通透性增加，血管和支氣管周圍組織可見大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主。咪喹莫特組小鼠炎癥程度較哮喘模型組減輕。見圖1。

2.2 BALF中細胞計數與分類 哮喘模型組BALF中細胞主要由嗜酸性粒細胞和單核細胞組成，細胞總數及各種炎癥細胞與正常對照組比較明顯增加;咪喹莫特治療組小鼠中的淋巴細胞和嗜酸性粒細胞比哮喘模型組顯著減少。見表1。

表1 三組小鼠BALF總細胞數及細胞分類比較(n=10，)

表1 三組小鼠BALF總細胞數及細胞分類比較(n=10，)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與哮喘模型組比較:2)P＜0.05

嗜酸性粒細胞正常對照組 1.81±0.172) 89.18±5.432) 2.44±1.82 7.83±0.87 0.53±0.142)組別 細胞總數(×106/L)各種炎癥細胞所占的比例(%)單核細胞 淋巴細胞 中性粒細胞哮喘模型組 8.86±0.851) 64.25±10.15 5.48±1.01 2.08±0.56 28.27±1.90咪喹莫特組 4.30±0.501)2) 79.38±8.121)2) 2.20±0.321) 8.46±0.66 9.84±1.251)2)

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液中IL-12、IL-13水平 哮喘模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-12水平較正常對照組降低，咪喹莫特組小鼠肺泡灌洗液中IL-12水平與哮喘模型組相比升高，但較正常對照組降低。哮喘模型組小鼠肺泡灌洗液中IL-13水平較正常對照組升高，咪喹莫特組小鼠肺泡灌洗液中IL-13與哮喘模型組比較降低，但較正常對照組升高。見表2。

圖1 三組小鼠肺組織病理切片(HE，×200)

表2 ELISA法檢測三組小鼠BALF中IL-12、IL-13 水平 (pg/ml，n=10，)

表2 ELISA法檢測三組小鼠BALF中IL-12、IL-13 水平 (pg/ml，n=10，)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與哮喘模型組比較:2)P＜0.01

IL-12 IL-13正常對照組 27.68±1.192)組別＜0.01 ＜0.01 30.88±1.50哮喘模型組 20.26±2.121) 37.14±1.631)咪喹莫特組 25.23±1.571)2) 32.75±2.452)F值 37.72 27.78 P值

2.4 各組小鼠肺組織TLR7 mRNA的表達 哮喘模型組小鼠肺組織TLR7 mRNA的表達(0.133±0.021)低于正常對照組(0.239±0.036)，咪喹莫特組小鼠肺組織TLR7 mRNA的表達(0.826±0.124)明顯高于哮喘模型組及正常對照組。見圖2。

圖2 小鼠肺組織TLR7 mRNA的表達

3 討論

哮喘的發病機制尚不十分清楚，近年來國內外研究表明免疫失衡在哮喘的發病機制中起著重要的作用，其中輔助T細胞(Th)亞群Th1/Th2細胞失衡是導致哮喘發病的重要環節。Th細胞分泌的多種細胞因子與哮喘的氣道炎癥和氣道高反應性關系密切，主要表現在Th1細胞功能減弱而Th2細胞功能增強。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-12，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13。IL-12是刺激Th1分化的最有力的細胞因子，能調節Th1/Th2免疫應答，促使Th0細胞向Th1分化，并促進多種細胞因子尤其是IFN-γ的分泌，抑制Th2細胞的功能，減少肺內嗜酸性粒細胞的浸潤，降低氣道的高反應性〔3〕。IL-13是一種多效性細胞因子，主要由Th2細胞產生，可誘導單粒巨噬細胞分化并延長其生存期，參與T、B淋巴細胞發育，調節Th1、Th2細胞功能;通過激活嗜酸性粒細胞，減少其凋亡，促進IgE分泌等機制，在哮喘等變態反應性疾病中發揮重要作用〔4〕。目前調整Th亞群的平衡成為開發哮喘治療藥物的重要方向，免疫治療已成為開發哮喘藥物治療的熱點。

TLR是新近發現的細胞跨膜受體，作為連接天然免疫與特異性免疫的關鍵元件，在急性炎癥反應、細胞信號轉導方面起重要作用，與哮喘炎癥與氣道重塑關系密切〔5〕。咪喹莫特(Imiquimod)是一種小分子干擾素誘導新型免疫調節劑，是Toll樣受體7的特異性配體，主要由巨噬細胞、B細胞、單核細胞和樹突狀細胞等抗原遞呈細胞所識別。它和這些細胞表面的TLR7特異性結合后，誘導Ⅰ型干擾素和Th1細胞因子IL-12等的產生〔6〕，抑制 Th2細胞因子 IL-4和 IL-13等分泌〔7〕，使原始 Th細胞向Th1細胞分化，提示咪喹莫特可能對治療以Th2反應為主的支氣管哮喘有效〔8〕。

本實驗結果顯示，哮喘小鼠支氣管平滑肌增厚，血管和支氣管周圍組織可見大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主;哮喘小鼠BALF中的IL-12水平降低而IL-13水平升高;這表明了Th1/Th2細胞免疫失衡是哮喘發病的關鍵機制，IL-12生成不足是哮喘發病的重要原因之一。Th1型細胞因子IFN-γ、IL-12減少和Th2型細胞因子IL-4、IL-13增多，將會增加感染呼吸道病毒的機會，促使哮喘加重〔9〕。實驗結果還顯示了哮喘小鼠肺組織中的TLR7 mRNA表達較正常組小鼠減弱，這也證實了Roponen等〔10〕研究中提到的Toll樣受體7的功能降低增加了患呼吸道疾病如哮喘的機率。

本實驗結果顯示，咪喹莫特組小鼠肺組織TLR7 mRNA較哮喘組小鼠表達增加，進一步論證了國外Jongdae等的研究成果即咪喹莫特可以上調TLR7基因的表達〔11〕的觀點。BALF中IL-12水平較哮喘組升高而IL-13降低，有利于Th1反應優勢的形成。組織病理學提示咪喹莫特組小鼠支氣管上皮組織增生及氣道周圍炎癥細胞浸潤較哮喘組顯著減輕，BALF中單核細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞較哮喘組明顯下降，提示該藥可以在一定程度上減輕哮喘的氣道炎癥。可能的機制為:①咪喹莫特與TLR7特異性結合，通過Toll樣受體7-MyD88依賴的信號系統誘導NF-κB的活性，促使TLR7 mRNA表達增加;②增加IL-12的水平，促進Th1的細胞應答反應，抑制Th2的體液免疫應答，使BALF中的嗜酸性粒細胞顯著降低;③降低IL-13的水平，使嗜酸性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞等趨化到炎癥部位受阻，表明了TLR7的配體咪喹莫特對支氣管哮喘有積極的保護作用。Du等〔12〕還發現在哮喘大鼠模型中，TLR7的配體 imiquimod通過降低血清中的IgE和Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-13來減輕哮喘的氣道炎癥和氣道重塑。

綜上所述，咪喹莫特在治療支氣管哮喘的實驗研究中，通過上調TLR7 mRNA表達，改變Th1/Th2及其細胞因子的組成，抑制支氣管及肺泡周圍的炎癥細胞尤其是下調嗜酸性粒細胞的浸潤，即促進Th1細胞及其細胞因子IL-12，抑制Th2細胞及其細胞因子IL-13。因此霧化吸入一定濃度的咪喹莫特可能是治療哮喘的一個新的免疫治療手段，也為臨床上治療哮喘提供了一個新的靶點。

1Mo¨ller-Larsen S ，Nyegaard M，Haagerup A，et al.Association analysis identifies TLR7 and TLR8 as novel risk genes in asthma and related disorders〔J〕.，2008;63:1064-9.

2 Hansbro NG，Horvat JC，Wark PA，et al.Understanding the mechanisms of induced asthma:New therapeutic direction〔J〕.Pharmacol Ther，2008;117:313-53.

3 Matsuse H，Kong X，Hu J，et al.Intranasal IL-12 produces discrete pulmonary and systemic effects on allergic inflammation and airway reactivity〔J〕.Int Immunop-harmacol，2003;3(4):457-68.

4 沈慧芳，尹 柯.哮喘患者血清IL-12、IL-13及IgE的測定及意義〔J〕.中國現代醫學雜志，2010;20(24):3796-801.

5 黃劍偉，莫碧文.Toll樣受體與支氣管哮喘〔J〕.中華哮喘雜志，2009;35:375-9.

6 Hudson J，Radzioch D，Camateros P，et al.Modulation of the allergic Asthma transcriptome following resiquimod treatment〔J〕. Physiol-Genomics，2009;38:303-18.

7 Camateros P，Tamaoka M，Hassan M，et al.Chronic asthma-induced airway remodeling is prevented by Toll-like receptor-7/8 ligand S2〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007;175:1241-9.

8 金淑賢，殷凱生，卞 濤，等.咪喹莫特對小鼠哮喘模型氣道炎癥和STAT6表達的影響〔J〕.第四軍醫大學學報，2006;27(6):548-52.

9 Xatzipsalti M，Kyrana S，Tsolia M，et al.Rhinovirus viremia in children with respiratory infections〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2005;172:1037-40.

10 Roponen M，Yerkovich ST，Hollams E，et al.Toll-like receptor 7 function is reduced in adolescents with asthma〔J〕.Eur Respir J，2010;35(1):64-71.

11 Jongdae Lee，Tsung-Hsien Chuang，Vanessa Redecke，et al.Molecular basis for the immunostimulatory activity of guanine nucleoside analogs:Activation of Toll-Like receptor 7〔J〕.Nat Immunol，2003;100(11):196-200.

12 Du Q，Zhou LF，Chen Z，et al.Imiquimod，a toll-like receptor 7 ligand，inhibits airway remodeling in a murine model of chronic asthma〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2009;36:43-8.