穩定表達水通道蛋白-4細胞株的建立及應用價值

張衛華 高 峰 (鄭州市中牟縣人民醫院檢驗科，河南 鄭州 45450)

視神經脊髓炎(NMO)是一種自身免疫性疾病〔1〕，患者血清中存在特異性自身免疫性抗體NMO-IgG〔2〕，該抗體能夠與水通道蛋白-4(AQP4)特異性結合，目前對該特異性抗體的檢測已被納入 NMO診斷標準〔3〕。本研究擬通過構建穩定表達AQP4抗原的HEK293細胞株，建立以其為底物的間接免疫熒光方法，檢測NMO患者血清中抗AQP4抗體，并與酶聯免疫吸附(ELISA)法進行比較，為NMO的血清學診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年Balb/c小鼠由河南省動物實驗中心提供。菌株 DH5α及HEK293細胞株購自Gibco公司，質粒pcDNA3.1為本室保存。血清標本取自鄭州大學第一、二附屬醫院和河南省人民醫院神經內科及眼科2010年1～10月住院患者，其中按照Wingerchuk等制定的NMO診斷標準(2006年修訂版本)臨床確診NMO患者15例(男4例，女11例，平均41歲)，按照McDonald2005年診斷標準臨床確診典型多發性硬化患者36例(男21例，女15例，平均34歲)，其他神經內科及眼科病例30例(男14例，女16例，平均45歲)。對照血清標本由本室提供，均為英國RSR公司AQP4抗體ELISA檢測試劑盒重復檢測3次后，確定的AQP4抗體陽性和陰性血清。

1.2 主要試劑 限制性內切酶EcoRI、NotI、T4DNA連接酶和RT-PCR試劑為TakaRa公司產品，質粒提取試劑盒為Vegen公司產品，RPMI1640為Gibco產品，Trizol及LipofectamineTM2000購自Invitrogen，兔抗AQP4多克隆抗體、FITC標記的山羊抗兔及山羊抗人IgG購自北京中杉金橋公司，AQP4自身抗體ELISA檢測試劑盒購自RSR公司。

1.3 AQP4基因的獲取 無菌狀態下取健康成年小鼠腦皮質，用Trizol試劑提取總RNA，并采用隨機引物將RNA逆轉錄成cDNA，參照Genebank公布的AQP4序列(U14007)進行引物設計:上 游 引 物:5'-TATCGAATTCATGAGTGACGGAGCTGCAGCGAGGCGGTGG-3';下游引物:5'-TATGCGGCCGCTCATACAGAAGATAATACCTCT-3'。上、下游引物分別含有 EcoRI和NotI酶切位點，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。電泳鑒定RT-PCR擴增結果。

1.4 重組質粒的構建 用限制性內切酶EcoRI和NotI分別對RT-PCR產物及載體質粒pcDNA3.1進行雙酶切，37℃條件下作用1 h。將酶切片段用T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α，接種到氨芐西林抗性LB平板培養過夜，次日挑取單克隆，擴大培養。堿裂解法抽提質粒，雙酶切鑒定重組質粒。

1.5 細胞轉染及穩定細胞株的建立 將2×105個HEK293細胞接種至6孔培養板，37℃ 5%CO2條件下培養至細胞融合達80% ～90%，然后按照LipofectamineTM2000的說明書進行質粒轉染。同時轉染空質粒pcDNA3.1作為對照組。37℃ 5%CO2條件下培養24 h后更換培養液并加入終濃度為800 μg/ml G418篩選。14 d后，挑取抗藥性克隆至24孔培養板，同時G418降至維持濃度400 μg/ml，以獲取穩定轉染的細胞株。

1.6 RT-PCR檢測AQP4在HEK293細胞中的表達 取篩選后的穩定細胞株采用Trizol試劑分別提取實驗組和空質粒對照組總RNA，然后以RT-PCR檢測細胞中AQP4的表達情況。

1.7 間接免疫熒光法檢測轉染細胞中AQP4的表達 將轉染重組質粒后篩選得到的HEK293細胞及轉染空質粒的HEK293細胞分別接種到6孔細胞培養板，孔中加有預先經多聚賴氨酸包被的蓋玻片。37℃ 5%CO2進行培養，當細胞融合達50% ～70%時，取出蓋玻片用4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.1%TritonX-100作用10 min，然后3%H2O2室溫作用5 min以消除內源性過氧化物酶活性。用3%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，傾除血清，在標本上滴加1∶50稀釋的兔抗AQP4多克隆抗體，室溫孵育2 h，pH7.4 PBS沖洗，5 min×3次，滴加 1∶100稀釋的FITC標記的山羊抗兔IgG，熒光顯微鏡下進行觀察，選用藍色激發光，陽性細胞顯示綠色熒光。

1.8 檢測抗AQP4抗體的兩種方法比較 ①間接免疫熒光法:按上述方法，在4%多聚甲醛室溫固定的HEK293細胞株上滴加1∶50稀釋后的患者血清，室溫孵育2 h，pH7.4 PBS沖洗3次，滴加1∶100稀釋的FITC標記山羊抗人IgG，室溫反應1 h，pH7.4 PBS沖洗3次，熒光顯微鏡進行觀察照相。②ELISA:按操作說明書進行。分別將25 μl血清標本加入預先包被有AQP4抗原的酶標孔中，同時設立陽性、陰性及空白對照。加入25 μl酶標二抗室溫振蕩孵育2 h，洗滌3次后加入100 μl底物SA-POD，室溫震蕩孵育20 min，再次洗滌3次后加入100 μl顯色劑TMB于暗處室溫靜置20 min，加入100 μl終止液震蕩5 s終止反應，陽性標本顯示黃色。

2 結果

2.1 AQP4基因的克隆 小鼠小腦皮質總RNA的PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳顯示在993 bp處出現目的條帶，條帶清晰且無雜帶(圖1)。

圖1 小鼠小腦皮質總RNA RT-PCR產物

2.2 重組質粒鑒定 pcDNA3.1-AQP4經EcoRI和NotI雙酶切得到5 428和993 bp兩個DNA片段，其中993 bp片段為與預期理論值相符的AQP4基因片段(圖2)。

2.3 RT-PCR檢測AQP4在HEK293細胞中的表達 轉染重組質粒的細胞組擴增出一條約993 bp的條帶，與理論值相符合，而轉染空質粒組無目的條帶的出現(圖3)。

2.4 間接免疫熒光法檢測轉染細胞中AQP4的表達情況 轉染重組質粒的細胞，抗原抗體反應后熒光顯微鏡下觀察，細胞表面呈綠色熒光，而轉染空質粒組細胞無熒光表達(圖4)。

2.5 NMO患者血清AQP4抗體檢測結果 ELISA法檢測15例NMO患者血清AQP4抗體均為陽性，其他病例均為陰性。而以本實驗建立的穩定細胞株為底物，用IFA法檢測發現，15例NMO血清中有14例呈陽性反應，其他除眼病和腦血管病患者血清各有1例呈陽性反應外，其余均為陰性。以ELISA檢測方法作為標準診斷法，IFA法的敏感性為93.3%(14/15)，特異性為97.4%(74/76)，正確指數為90.7%，假陽性率為3.0%，一致性為96.3%。

圖2 重組質粒pcDNA3.1-AQP4酶切鑒定結果

圖4 間接免疫熒光檢測AQP4的表達(×200)

3 討論

NMO患者體內特異性NMO-IgG是能與AQP4結合的高親和性和高特異性IgG抗體，兩者結合影響了AQP4的正常功能，并且所形成的免疫復合物通過激活補體而導致炎性脫髓鞘、硬化、壞死及血管的透明樣變性〔4〕，從而引發NMO。目前對NMO的診斷主要依靠臨床表現及頭顱、脊髓磁共振成像(MRI)的影像學指標。但該病臨床表現復雜，且易與多發性硬化相混淆，臨床醫生較難依據癥狀準確進行診斷。雖然MRI在NMO的診斷上具有特異性，但早期不易確診，需注意動態觀察，不能一次檢查而定診。NMO患者體內特異性NMO-IgG抗體的發現，為該病的診斷提供了新的方法〔3，5〕。由于NMO-IgG具有高度特異性，可用于鑒別NMO和多發性硬化〔6〕，且在疾病初期即可通過免疫學方法檢測到，從而有效減少了誤診和漏診，保證了早診早治，使病人預后大大改善。因此獲取AQP4抗原是進行NMO-IgG抗體檢測的關鍵步驟。本研究選擇小鼠作為AQP4基因來源由于取材于動物，且鼠類與人類之間AQP4抗原的差別不會影響該抗原與NMO病人NMO-IgG抗體結合〔7〕。

將目的基因導入細胞獲得穩定表達的細胞株是本實驗的重要環節，而選擇高效、穩定的轉染載體則是重要的前提。本實驗選擇質粒pcDNA3.1作為載體，除了該載體是真核表達載體、具有較為穩定的轉染效果，而且還由于該載體含有抗新霉素(NeoR)標記基因，可以通過試劑G418來篩選穩定轉染的細胞，未被轉染的細胞則無法存活。本實驗表明真核表達載體pcDNA3.1-AQP4構建成功。所建立的穩定表達 AQP4的HEK293細胞在NMO的臨床診斷中具有良好的應用前景。

1 Misu T，Fujihara K，Kakita A，et al.Loss of aquaporin 4 in lesions of neuromyelitis optica:distinction from multiple sclerosis〔J〕.Brain，2007;130(Pt 5):1224-34.

2 Lennon VA，Kryzer TJ，Pittock SJ，et al.IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water channel〔J〕.J Exp Med 2005;202:473-7.

3 Wingerchuk DM，Lennon VA，Pittock SJ，et al.Revised diagnostic criteria for neuromyelitis optica〔J〕.Neurology，2006;66(10):1485-9.

4 Kinoshita M，Nakatsuji Y，Moriya M，et al.Astrocytic necrosis is induced by anti-aquaporin-4 antibody-positive serum〔J〕.Neuroreport，2009;20(5):508-12.

5 Petzold A，Pittock S，Lennon V，et al.Neuromyelitis optica-IgG(aquaporin-4)autoantibodies in immune mediated optic neuritis〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2010;81(1):109-11.

6 Marignier R，De Sèze J，Vukusic S，et al.NMO-IgG and Devic's neuromyelitis optica:a French experience〔J〕.Mult Scler，2008;14(4):440-5.

7 Bradl M，Misu T，Takahashi T，et al.Neuromyelitis optica:pathogenicity of patient immunoglobulin in vivo〔J〕.Ann Neurol，2009;66(5):630-43.