p16、ki-67在宮頸鱗癌及宮頸上皮內瘤變組織中的表達及臨床意義

田 琦 孟 剛 (吉林省腫瘤醫院，吉林 長春 130012)

宮頸癌的形成和演變是一個多因素、多基因共同參與的復雜而漫長的過程，經歷宮頸上皮增生鱗化、宮頸上皮內瘤變(CIN)、宮頸浸潤癌等不同階段。p16、ki-67作為癌基因，直接作用于細胞周期，參與細胞增殖與分裂，促進腫瘤生成。本文應用免疫組化S-P法，觀察p16、ki-67在宮頸鱗癌及CIN中的表達，旨在探討二者在宮頸癌發生、發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 標本均來自2009年10月至2010年12月本院病理科存檔資料，其中宮頸鱗癌38例，年齡26～75(平均42)歲，術前未接受過其他治療，CIN標本96例，其中CINⅠ、Ⅱ和Ⅲ分別為28、32和36例，年齡28～65(平均45)歲，收集因子宮肌瘤行子宮手術的正常宮頸組織14例作為對照。

1.2 主要試劑 兔抗人p16多克隆抗體購自福州邁新生物技術有限公司，ki-67為ZM-0166單抗，工作液由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3 免疫組化染色及結果判定 全部標本均經10%甲醛固定，常規石蠟包埋后連續切片，每例標本行HE染色及S-P免疫組化染色，光鏡觀察。免疫組化步驟按照S-P試劑盒說明書進行，一抗濃度為1∶100，由福州邁新技術有限公司及北京中杉金橋技術有限公司提供的陽性對照片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。p16陽性判定標準:p16陽性表達定位于細胞核和細胞質，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽性信號，每例隨機觀察5個高倍視野，用半定量積分判斷結果:陽性細胞≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分，陽性強度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，兩項積分相乘，0分為陰性(－)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，9～12分為強陽性()。ki-67陽性判定標準:ki-67陽性表達于細胞核，呈棕黃色顆粒，或細胞核、細胞質同時呈棕黃色，于40倍光鏡下計數100個細胞，每例標本計數1 000個細胞，ki-67指數=陽性細胞數總和/1 000×100%。

1.4 統計學方法 采用χ2檢驗、t檢驗及相關分析。

2 結果

2.1 宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織中p16表達 p16在CIN、宮頸鱗癌組織中有豐富表達，陽性表達定位于細胞核和細胞質，在正常宮頸組織中不表達。p16表達的陽性程度:宮頸鱗癌接近于CINⅢ高于 CINⅠ、Ⅱ(χ2=6.24，P＜0.05)，CIN 中p16表達率為63.54%，隨CIN級別的升高而提高，CINⅢ高于CINⅡ(χ2=4.23，P ＜0.05)，CINⅡ高于 CINⅠ(χ2=4.56，P ＜0.05)，正常宮頸組織與CINⅠ間及CINⅢ與宮頸鱗癌間差異不顯著(P＞0.05)。見表1。

表1 CIN、宮頸鱗癌及正常宮頸組織中p16表達

2.2 CIN、宮頸鱗癌及正常宮頸組織中ki-67指數 ki-67陽性表達于細胞核，呈棕黃色顆粒，在宮頸鱗癌及CIN中有較豐富的表達，在正常宮頸組織中為弱陽性表達。ki-67指數:宮頸鱗癌(67.82±15.31)高于 CINⅠ、Ⅱ(t=6.18，P＜0.05)，CIN(40.36±11.12)高于正常宮頸組織(2.83±4.56)(t=5.36，P＜0.05)，CINⅢ(60.81±14.32)高于 CINⅡ(29.65±12.58)(t=6.58，P ＜0.05)，CINⅡ高于 CINⅠ(21.42±10.82)(t=2.15，P＜0.05)，宮頸鱗癌、各期別CIN的ki-67指數較正常宮頸明顯增加(P＜0.05)。

2.3 宮頸鱗癌及各期別CIN中p16的表達強度與ki-67指數間呈正相關(P1＜0.05，r1=0.92;P2＜0.05，r2=0.96)。

3 討論

CIN是宮頸癌癌前病變，尋找并發現宮頸癌發生、發展過程中相關的敏感指標，對阻斷癌前病變的發展，減少宮頸癌的發生，幫助臨床工作中早期診斷、早期治療，判斷其轉歸，都有著重要的指導意義。

p16基因定位于人第9號染色體短臂2區1帶(9P21)，由3個外顯子和2個內含子組成，為周期蛋白依賴激酶抑制劑，是直接參與細胞周期調控的抑制基因，其蛋白產物p16蛋白為細胞周期蛋白D/CDK激酶抑制因子，通過與細胞周期蛋白D(cyclin D1)競爭性結合CDK4/CDK6，特異性抑制CDK4、CDK6的消化活性，從而抑制視網膜母細胞瘤蛋白(Rb)磷酸化和轉錄調節因子E2F的釋放，形成對CDK4-cyclinD1-Rb-E2F的負反饋調節，阻斷細胞由G1期至S期的增殖，引起細胞周期調節紊亂，導致細胞癌變〔1～3〕。Salit〔4〕等在研究高危 HPV 感染宮頸鱗癌和p16表達的關系中發現，p16與HPV16/18表達呈正相關，提示p16的過度表達是繼高危HPV感染之后發生的。

本研究中發現，p16蛋白在正常宮頸組織中不表達，在宮頸癌癌前病變CIN中，隨著CIN級別增加，表達逐漸增強，在宮頸癌中過度表達，說明p16在正常宮頸至CIN，直至最終發展為宮頸癌的過程中，呈現一個漸進表達過程，與腫瘤細胞生長失控有密切的關系，這在其他相關研究中也得到證實。

ki-67抗原是一種反映細胞增殖期的核抗原基因，是細胞增殖活性的指標，定位于人第10號染色體，在維持細胞增殖活性中起著重要作用，ki-67抗原在G0期缺失，在G1、S、G2/M期均有合成，準確反映細胞的增殖活性，對預測癌前病變向惡性病變轉化有重要的參考價值，對惡性腫瘤的早期診斷、早期治療有指導意義〔5，6〕。

本研究結果顯示，正常宮頸組織、CIN和宮頸癌組織中的ki-67陽性表達有顯著差異，表明宮頸癌的發生、發展與細胞增殖有密切關系。本研究結果還顯示，宮頸癌及CIN中p16的表達強度與ki-67指數間呈現正相關，通過加快細胞增殖的作用，促進宮頸癌的發生、發展。

1 Khoo CM，Carrasco DR，Bosenberg MW，et al.Ink4a/Arf tumor suppressor does not modulate the degenerative conditions or tumor spectrum of the telomerase-deficient mouse〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2007;104(10):3931-6.

2 Eleuterio J Jr，Giraldo PC，Goncalves AK，et al.Prognostic markers of high-grade squamous intraepithelial lesions:the role of p16INK4a and high-risk human papillomavirus〔J〕.Acta Obstet Gynecol Scand，2007;86(1):94.

3 Cunningham LL Jr，Pagano GM，Li M，et al.Overexpression of p16INK4 is a reliable marker of human papillomavirus induced oral high-grade squamous dysplasia〔J〕.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006;102(1):77-81.

4 Salit IE，Tinmouth J，Chong S，et al.Screening for HIV-associated anal cancer.correlation of HPV genotypes，P16，and E6 transcripts with anal pathology〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009;18(7):1986-92.

5 余 俐，彭杰青，陳尚武.宮頸上皮內瘤變中P16INK4A和Ki-67的表達〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2007;23(6):665.

6 顧依群，高子芳，汪穎南，等.P16INK4A、P53、Ki-67及ER在宮頸病變中表達的臨床病理學意義〔J〕.診斷病理學雜志，2008;15(2):131.