COPD基因和基因組學研究進展

虢 毅 鄧 昊 羅自強 (中南大學湘雅醫學院生理學系，湖南 長沙 4003)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以氣流受限為特征的慢性氣道疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發展，包括肺氣腫、慢性支氣管炎和末梢氣道疾病。COPD位居常見病死亡原因第四位，WHO報導2030年COPD將成為世界第三大致死疾病〔1〕。COPD發病機制復雜，與多個基因變異及環境因素相互作用有關〔2〕。吸煙是COPD的主要環境危險因素，然而重度吸煙者僅10% ～20%發病，且少數終生不吸煙者患COPD〔3〕，故COPD具有內在遺傳易感性。人類基因組計劃和國際人類基因組單體型圖項目(HapMap)完成，以及后基因組新技術開展使COPD遺傳研究取得了一定進展。本文就COPD基因和基因組學最新研究進展作一綜述。

1 候選基因研究(candidate genes study)

該方法主要通過病例對照和家系研究檢測涉及COPD的病理生物學途徑基因，并鑒定疾病的遺傳風險因素。但僅能研究功能較清楚的、對COPD發生有促進或抑制作用的基因，而未涉及大量未知功能的基因。

基于對COPD病理遺傳機制理解，目前研究的候選基因主要是參與水解和抗水解、氧化和抗氧化、炎癥反應、有毒物質代謝、氣道高反應性和主動防御機制等的基因〔2，3〕。普遍公認的COPD候選基因是酯酶抑制劑1基因(protease inhibitor 1，PI;又稱α1-抗胰蛋白酶基因或SERPINA1)。PI基因位于14q32.1，編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制蛋白水解來保護肺，約1% ～2%的COPD是由α1-抗胰蛋白酶遺傳缺陷所引起〔4〕。PI變異可增加COPD患病風險6～50倍，是目前報道的最高風險〔5〕。

人類未鑒定基因(Human Unidentified Gene-Encoded，HUGE)蛋白質數據庫中共有94個基因和89個代謝通路與COPD表型相關，427個哮喘相關基因中有35個與COPD相關。表1總結了至少有3篇陽性文獻的COPD候選基因。絕大多數相關性研究重復性較差，類似其他復雜人類疾病〔6〕。Hersh等通過家系研究和病例對照研究12個COPD相關基因29個變異，發現表面蛋白B基因的Thr131Ile變異、血紅素氧合酶基因啟動子短串聯重復(GT)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)啟動子變異-308G＞A、微粒體環氧化物酶基因“快”等位基因型 His139Arg與 COPD 相關〔7〕。

Smolonska等對近20年來COPD候選基因研究文獻進行數據分析，發現僅5個變異〔3個轉化生長因子β1(TGFβ1)變異、谷胱甘肽轉移酶(GSTM1)無效等位基因和白介素1受體拮抗劑基因(IL1RN)串聯重復數目變異〕與 COPD顯著相關〔8〕。Castaldi等對涉及72個基因的COPD病例對照研究文獻進行meta 分 析，僅 TGFβ1 rs1800470、GSTM1 Null allele、SOD3 rs1799896和TNF rs1800629與COPD顯著相關〔9〕。出現結果不一致的原因有人群差異(表型定義差異、正常對照或COPD亞型和/或種族差異)、人群分層、多重檢測、抽樣誤差或樣本數小、缺乏效力、數據解釋不正確、基因分型錯誤和遺傳覆蓋不全等。遺傳和環境異質性也會造成實驗結果不一致〔2，3〕。

2 全基因組連鎖分析(Genome-wide linkage analysis)

全基因組連鎖分析的目標是確定疾病易感基因的染色體區域。該方法不需要疾病或表型的生物學先驗知識，并可得到染色體區間進行基因精細定位。但COPD為遲發性疾病，具有家系數據收集復雜性。目前全基因組連鎖研究主要探討氣道阻塞的基因位點，大多集中在肺通氣功能測量，而不是COPD本身。

相關主要連鎖研究包括兩個健康人群(弗雷明漢心臟研究和國家心臟、肺、血液研究所家系心臟研究)和兩個COPD患者人群(波士頓早發型COPD研究和猶他州遺傳家系研究)〔2，3〕。研究中發現與第1秒用力呼氣量/用力肺活量(FEV1/FVC)比率最強烈連鎖證據分別在4號和2號染色體長臂。兩個健康人群的連鎖分析主要確定了染色體6q、21p和4p上的強烈的連鎖信號以及18號染色體上的暗示性連鎖信號。波士頓早發型COPD研究資料主要用于確定相關位點，對參與研究的72個家系585成員進行了四次全基因組篩查。第一次發現12q、19和22號染色體與COPD相關。第二次發現2q與FEV1/FVC比率相關。第三和四次研究中，使用后支氣管舒張值FEV1/FVC和最大氣流量(FEF)25%～75%等指標，發現2q和12p與早發型COPD強相關。猶他州遺傳家系研究也在染色體2q和5q觀察到FEV1/FVC的暗示性連鎖的標記。隨后Celedon等應用額外標記精細定位了染色體19q區域〔10〕。進一步研究在總計4個獨立的人群證實SERPINE2與COPD表型顯著相關，其中大部分 SNP位于染色體2q上觀察到的連鎖信號區域〔11，12〕。因此SERPINE2被視為定位克隆確定的第一個COPD易感基因。但Chappell等在更高檢測效力的病例對照研究中無法重復此結果〔13〕。

一些研究者進行了后續研究以尋找疾病或易感基因。COPD相關基因大量報道是由于基因組中海量基因和大量易感位點的發現。疾病表型基因雖然處于連鎖峰下，但主要是這些基因湊巧在與疾病表型連鎖的染色體區域被發現，遺傳變異能否解釋連鎖信號仍然未知。少數基因處于連鎖峰可作為最可能的候選基因而被研究。Hersh等最近對波士頓早發型COPD研究確定的染色體2q上連鎖區域進行精細定位和人群掃描，鑒定DNA雙鏈斷裂修復基因(X-ray repair，complementing defective，in Chinese hamster 5，XRCC5)為 COPD 易感基因〔2，3，14〕。COPD病因學中影響蛋白酶和抗蛋白酶之間的平衡是一個長期的假設，在弗雷明漢心臟研究確定了染色體6q上的強烈的連鎖信號〔2，3，15〕，因此位于 6q 的第二信使操縱鈣通道蛋白(the secreted modular calcium-binding protein 2，SMOC2)基因可考慮為COPD候選基因。Wilk等發現SMOC一些單核苷酸多態性(SNP)和單體型與肺功能相關，但SMOC變異無法解釋染色體6q上觀察到的強烈連鎖信號〔16〕。染色體19q13上TGFβ1 SNP在兩個獨立的人群中均與COPD表型相關，同樣也沒有證據表明TGFβ1遺傳變異造成連鎖峰〔10〕。

表1 COPD候選基因(發表陽性報道數至少3篇)〔3，4〕

氣流阻塞是哮喘患者的主要特點，哮喘和COPD是不同的病理生理過程并且機制不明。哮喘和COPD氣道對阻塞的貢獻難以量化，但導致氣流受限有可能存在共同的基因。在哮喘家系中應用全基因組掃描已鑒定與肺功能連鎖的位點，包括中國家系中16p和10p、法國家系中6q和21q、荷蘭家系中2q、澳大利亞家系中20q和12q以及哥斯達黎加家系中5p〔2〕，可能涉及COPD發病。

3 全基因組關聯研究(genome-wide association studies，GWAS)

人類基因組計劃和HapMap的完成使復雜疾病遺傳學的GWAS成為現實。候選基因和家系連鎖的研究受限于感興趣的基因組區域，而GWAS對整個基因組成千上萬個SNP研究，以確定那些與疾病癥狀同時出現的SNP。GWAS作為一種復雜疾病遺傳研究新方法已取得一定進展，如年齡相關性黃斑變性、糖尿病、克羅恩病和哮喘等〔17，18〕。

目前GWAS僅2篇文獻涉及COPD，但有4篇文獻涉及肺通氣功能(COPD重要表型)。Pillai等首次對來自挪威823個COPD患者和810個吸煙對照進行分析，發現15號染色體上一個SNP(rs8034191)與COPD顯著相關，這一結果在其他三個研究人群得到驗證。另一位于4號染色體上Hh相互作用蛋白(hedgehog interacting protein，HHIP)基因也與FEV1/FVC相關，可能是 COPD重要風險位點〔19，20〕。rs8034191附近有多個基因，其中包括幾個煙堿型乙酰膽堿受體的亞基(CHRNA3和CHRNA5)和鐵結合蛋白(iron-binding protein，IREB2)〔19〕。最近有三個獨立的報告報道這個位點也與肺癌易感性相關，并且與周邊血管疾病和尼古丁成癮相關，暗示此位點也許因為吸煙而與COPD和肺癌都相關〔20〕。第二次對3個人群2 940個COPD患者和1380個對照GWAS發現4q22.1位點多肽熒光標記(family with sequence similarity 13，member A，FAM13A)基因與COPD相關〔21〕，結果在最近關于肺功能的 GWAS中得到證實〔22〕。FAM13A可能在信號轉導方面有一定作用。對Pillai等報道的CHRNA3-CHRNA5-IREB2位點和HHIP基因進行了基因分型未發現統計學差異〔19，21〕。

前兩次肺功能的GWAS均在弗雷明漢心臟研究中心進行。第一次研究涉及10種肺量測定法和70 987個常染色體SNP。依據全基因組顯著性嚴格標準，未發現SNP與肺功能表型相關。然而，還是支持一些已報道的COPD相關基因，如CFTR、SOD3和GC基因。但這些候選基因中SNP覆蓋率特別低，作為證據并不理想〔23〕。第二次研究包括7 691名參與者，主要研究表型為FEV1/FVC〔24〕。人群研究中4q的4個SNP與FEV1/FVC顯著相關，其中一個SNP在家系研究中也與FEV1/FVC相關。同一區域的SNP在三個獨立人群研究中也顯示與COPD相關的證據〔19〕。幾個最強烈相關的SNP位于4q31，與HHIP基因接近，但是該區域的功能性變異未鑒定。未發現弗雷明漢人群與CHINA 3/5區域顯著相關。Hancock等對4個組群20 890個歐洲后裔多個GWAS結果進行數據分析，對吸煙狀態進行人群分層，發現8個與FEV1/FVC相關的基因位點(HHIP、GPR126、ADAM19、AGER-PPT2、FAM13A、PTCH1、PID1和 HTR4)，1 個與 FEV1 相關的位點 INTS12-GSTCD-NPNT〔22〕。最近一次肺功能GWAS確定了5個新的肺功能相關位點和候選基因:4q24(GSTCD)、2q35(TNS1)和5q33(HTR4)與FEV1相關，6p21(AGER和DAMM2)和15q23(THSD4)與FEV1/FVC相關〔25〕。此并未觀察到CHRNA3-CHRNA5-CHRNB4位點與吸煙暴露、肺癌、肺道上皮疾病和 COPD 相關〔19，25〕。

COPD GWAS處于起步階段，統計學上最可能相關是4號和15號染色體〔19〕。GWAS可提供更大的分辨率和更大的能力來找到共同的易感性變異〔18〕，COPD和COPD相關表型(肺通氣功能等)的GWAS的研究可能為COPD病理生理學提供新的思路。

4 基因表達研究(gene-expression studies)

全基因組表達研究能同時分析數千基因和/或基因簇的基因表達模式，篩選可能的COPD候選基因。人類COPD肺組織的全基因組表達研究很少，各研究在樣本類型、實驗設計以及數據分析方法等方面均有所差別。對4個人類COPD肺組織的全基因組表達研究結果進行分析，發現在單個研究中鑒定的基因在生物學意義上高度重疊，但表達差異的基因大多不能重復〔26〕。Steiling等總結文獻中COPD氣道基因和MicroRNA的表達差異，提出氣道基因表達差異可深化COPD臨床表型異質性的理解〔27〕。Bhattacharya等在有或無COPD的群組分析中鑒定了220個基因，它們在肺組織的表達與COPD相關表型相關〔28〕，而另一基因表達研究中，表達差異性可作為吸煙者中重度COPD與輕微或無COPD的生物學標記〔29〕。

吸煙可造成遍布整個呼吸道的上皮細胞的“分子損害區域”，因此有一些研究集中在正常和COPD吸煙者的氣道上皮細胞基因表達圖譜。氣道上皮基因表達反應了吸煙的宿主反應和損害程度，這些研究可能促進對COPD發病相關進程的了解〔20〕。Pierrou等在正常和有COPD的吸煙者支氣管氣道中鑒定了200個氧化應激相關基因的差異表達〔30〕，其中很多曾發現在COPD肺組織中差異表達〔29，30〕。DeMeo等檢測了 COPD相關的889個SNP，發現15q25.1上IREB2(iron regulatory protein 2)基因變異與COPD顯著相關，COPD肺組織標本中mRNA和蛋白表達增加〔31〕。Tilley等發現Notch通路基因在吸煙COPD患者小氣道細胞中下調〔32〕。

總之，人類基因組計劃和Hap Map完成提供了全基因組水平上研究COPD遺傳機制的平臺。COPD遺傳學研究在過去幾年取得了一定進展，候選基因研究、全基因組連鎖分析和全基因組關聯研究都是剖析COPD遺傳機制的重要手段，但COPD氣道和肺組織的全基因組表達研究較少。候選基因和全基因組研究的整合最終將產生一個全面的COPD分子藍圖，從而對COPD發病機制提供新的思路，促進病理遺傳學治療靶點鑒定和臨床應用。

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