CD14mRNA的表達在急性腦出血腸-肝軸紊亂中的作用及星蔞承氣湯的干預研究

趙海濱，唐杰，馬立華，王威，王帥，張秀靜

急性腦出血是神經系統多發病和常見病，可引起一系列內分泌功能紊亂，嚴重可導致全身炎癥反應綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)，或多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。急性腦出血時，腸黏膜屏障受損，通透性增加，細菌易位，形成腸源性內毒素血癥，最終導致肝損害；隨著肝損害的進一步加重，肝臟對內毒素清除能力下降，加重內毒素血癥。兩者互為因果，惡性循環。腦出血急性期多表現為“痰熱腑實證”，發在顱內(上)，治在胃腸(下)，清熱通腑化痰是臨床常用治法。本研究旨在既往急性腦出血模型研究的基礎上，闡述肝、腸系膜淋巴結CD14表達的動態變化在急性腦出血應激性肝損害中的作用及星蔞承氣湯的干預效應。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 成年健康雄性SD大鼠88只，體重(220±20)g，由北京中醫藥大學實驗動物中心提供。采用隨機數字表法將大鼠分為正常組(A組，n=24)、單純腦出血組(B組，n=24)、腦出血痰熱腑實證組(C組，n=24)和星蔞承氣湯組(D組，n=16)。其中A、B、C組分24 h、48 h、72 h 3個時間亞組，D組分48 h、72 h兩個時間亞組，每個時間亞組各8只。

1.2 實驗材料 星蔞承氣湯顆粒劑由北京康仁堂中藥有限公司提供；總RNA抽提試劑Trizol由Invitrogen公司提供，5×SYBR Green PCR Master Mix由AB Applied Biosystems公司提供；dNTP由Solarbio公司提供；OligodT、Rnasin、M-MLA由Promega公司提供；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；采用Agilent Technologies stratagene M×3000 P熒光定量儀。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制作 A組：不予造模處理，正常飲食。B組：復制腦出血模型[1-2]。用1%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉，俯臥固定于動物頭顱立體定位儀上。根據大鼠大腦立體定位圖譜，調整立體定向儀使門齒溝平面比耳間線平面低2.4mm，此時前囟和后囟基本上在同一平面上；將頭部背側的鼠毛剪去，皮膚消毒后頭皮丁字切開，暴露顱骨，取前囟為原點，向右3mm，向前0.1mm處用牙科鉆鉆一直徑約lmm的圓孔，采用微量注射器沿鉆孔方向垂直進針，深約6mm(為尾狀核位置)，進針后緩慢注射Ⅶ型膠原酶/肝素鈉/生理鹽水溶液2μl(每μl含Ⅶ型膠原酶0.25 U及肝素2 U)，留針2min，緩慢退針，骨蠟封閉顱骨鉆孔，消毒，縫合皮膚。C組：腦出血模型手術前2 d起，復制痰熱腑實證模型[3-4]。用10%自體糞便1ml/100 g灌胃，每天1次，連續3d。D組：復制急性腦出血痰熱腑實證模型，于腦出血造模手術前2 d以1.08ml/kg開始灌胃給予星蔞承氣湯，每天1次，造模前2 h加灌1次，造模后每天灌胃1次，各時相點處死前2 h加灌1次。

術后見大鼠明顯出現糞便干結、煩躁、鼻分泌物多、喉中痰鳴、肢體癱瘓等癥狀者為模型制備成功。A、B、C組分別于造模后24 h、48 h、72 h處死，D組于造模后48 h、72 h處死。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測 檢測腸系膜淋巴結A、B組各時間點及肝各組各時間點CD14mRNA表達水平。

1.3.2.1 肝、腸系膜淋巴結組織總RNA的提取 每組各時間活殺大鼠，1min內切取肝、腸系膜淋巴結組織，在冰塊上切取50～100mg的肝、腸系膜淋巴結，采用Trizol提取組織的總RNA，操作按說明進行。所得RNAA260/A280＞1.8，并計算出RNA含量。

1.3.2.2 cDNA的合成 RNA樣品取10μg，依次加入5×RT Buffer 5μl，Oligo(dT)1μl，dNTP 1μl，RNA-sin 1μl，M-MLA反轉錄酶1μl，無RNase水補足至總體積25μl。反應條件：42℃1 h；95℃ 15min，4℃10min。得RT終溶液即為cDNA溶液。

1.3.2.3 實時定量PCR 每種組織均以CD14和β-actin基因引物進行定量PCR反應，在96孔PCR板中進行。CD14引物：上游：5'-TTG TTG CTG TTG CCT TTG AC-3'，下游：5'-CGT GTC CAC ACG CTT TAG AA-3'，擴增產物長度為214 bp。β-actin引物：上游：5'-AGA TCC TGA CCG AGC GTG GC-3'，下游：5'-CCA GGG AGG AAG AGG ATG CG-3'，擴增產物長度為138 bp。每個PCR反應體系中含5×SYBR Green PCR Master Mix 12.5μl，DEPC 水 6.5μl，上下引物混合1μl，cDNA 5μl。PCR反應的條件95℃預變性10min；95℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸20 s，共40個循環；β-actin共35個循環。

1.3.2.4 結果分析 實時熒光定量PCR產物利用Mxpro QPCR Software 4.10(For Mx3000P and Mx3005P QPCR Systems)系統進行統計分析，可觀察擴增曲線，各組選取集中度較高的數據，對cDNA的含量進行定量分析，計算樣本的ΔΔCt值，以2ΔΔCt表示樣品中目的基因mRNA相對表達量。

1.3.3 病理形態學檢查 于上述各時相點分別活殺大鼠，取肝右后葉組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋后切片，常規HE染色，并在光鏡下進行病理觀察。

1.4 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件，所得數據均用(±s)表示，組間比較采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 實時熒光定量PCR CD14mRNA標準曲線相關系數為0.993，說明定量結果準確，通過公式計算出擴增效率為1.083。每輪反應后溶解曲線呈單峰，說明擴增產物單一，未檢測到二聚體及非特異性產物，排除了假陽性結果的可能。見圖1、圖2。實時熒光定量PCR檢測結果顯示，在急性腦出血24 h內肝腸CD14mRNA表達升高，48 h達高峰，72 h回落。肝臟CD14mRNA檢測結果顯示，B組各時間點CD14mRNA表達較同期A組均升高(P＜0.05)，D組各時間點CD14mRNA表達較同期C組均有所降低(P＜0.05)甚至接近正常；腸系膜淋巴結CD14mRNA檢測結果顯示，B組各時間點CD14mRNA表達較同期正常組A組均升高(P＜0.05)。見表1、表2。

2.2 肝組織病理學改變 A組：光鏡下見肝小葉結構正常，無肝細胞變性壞死，肝細胞索排列整齊，肝竇及中央靜脈無異常。見圖3。C組：24 h組見肝組織小部分區域濁腫，肝血竇結構不清晰，小部分細胞核界限不清及胞漿氣球樣變(圖4)；48 h組見肝細胞變性加重，濁腫及氣球樣變區域擴大，肝細胞界限不清，部分細胞核溶解消失及胞漿氣球樣變(圖5)；72 h組見肝細胞變性進一步加重，肝細胞界限不清晰，大部分細胞核溶解消失，胞漿極度疏松，氣球樣變占據肝臟大部分區域(圖6)。B組病理改變與C組大致相同(圖略)。D組：48 h見肝細胞變性壞死有所減輕，大部分細胞核存在，細胞界限清晰，部分細胞呈濁腫現象(圖7)；72 h組見肝臟組織結構較完整，絕大部分細胞核存在，細胞界限清晰，少數細胞呈濁腫現象(圖8)。

圖1 大鼠肝CD14mRNA溶解曲線圖

圖2 大鼠腸系膜淋巴結CD14mRNA溶解曲線圖

圖3 A組HE染色(20×)

圖4 C組24 h HE染色(20×)

圖5 C組48 h HE染色(20×)

圖6 C組72 h HE染色(20×)

圖7 D組48 h HE染色(20×)

圖8 D組72 h HE染色(20×)

3 討論

本研究發現，急性腦出血24 h肝、腸系膜淋巴結CD14mRNA表達升高，48 h達高峰。腸道是機體最大的細菌和內毒素貯庫。正常情況下，由腸道細菌產生的內毒素大部分隨糞便排出體外，小部分被腸道黏膜吸收，經門靜脈達肝血竇，被肝臟枯否氏細胞通過吞飲作用而被清除[5]。急性腦出血后下丘腦功能紊亂，腦腸肽平衡失調，腸道屏障結構破壞，此外腸道缺血、缺氧還可使腸道內厭氧菌和兼性菌優勢繁殖，使內毒素的生成增加[6-8]，細菌和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)大量易位，最終導致腸源性內毒素血癥。CD14為LPS高親和力受體，發生內毒素血癥時，LPS與CD14相結合，LPS通過脂多糖-脂多糖結合蛋白-可溶性CD14(LPS-LBP-sCD14)三聯復合物作用于Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)并激活髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)，活化的MyD88可結合白細胞介素-1受體相關激酶(Interleukin-1 receptor-associated kinase,IRAK)和白細胞介素-1受體相關激酶-2(Interleukin-1receptor-associatedkinase-2,IRAK-2)，然后作用于腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF6)，進一步激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)信號轉導通路[9]，介導增強免疫反應和炎癥反應，從而造成肝損害。

表1 各組各時間點肝臟CD14mRNA實時熒光定量結果

表2 A、B組個時間點腸系膜淋巴結CD14mRNA表達

從肝CD14mRNA表達及組織病理學改變看，通過星蔞承氣湯干預后，肝損害程度逐漸減輕。星蔞承氣湯具有“瀉下”排毒的作用，通過排出腸道積滯，使腸道內細菌和內毒素隨腸內容物排出體外，減少腸源性內毒素的產生和吸收，減少細菌移位，起到“釜底抽薪”、蕩滌腸道細菌的作用。另外，下調巨噬細胞活性，減少TNF-α等炎癥細胞因子的產生和釋放，調節促炎介質與抗炎介質間的平衡，抑制巨噬細胞的激活，阻滯局部的炎癥因子前體釋放，減輕全身炎癥反應[10]。由此可見，星蔞承氣湯可改善急性腦出血時大鼠腸道菌群失調及腸道通透性，降低血漿內毒素水平，改善肝臟病理改變，對腸-肝軸紊亂的生物學效應具有明顯阻斷作用，對急性腦出血時大鼠肝臟具有保護作用。

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