生殖器皰疹患者超氧化物歧化酶活力及自然殺傷細(xì)胞表達(dá)的檢測(cè)

鄒明華 李楚潮 劉臘鳳 劉瓊芬

生殖器皰疹(genital herpes，GH)是常見的性傳播疾病之一，由I型單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus type 1，HSV-1)或Ⅱ型單純皰疹病毒(HSV-2)引起的一種性傳播疾病，臨床主要由HSV-2感染引起［1］。GH發(fā)病率逐年增高，易反復(fù)發(fā)作，給患者和社會(huì)帶來沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1，2］。GH的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，有研究顯示HSV病毒感染機(jī)體后，引發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫紊亂及氧化應(yīng)激狀態(tài)失衡，主要是T細(xì)胞水平表達(dá)低下、Th細(xì)胞及Tc細(xì)胞分化偏態(tài)［2，3］。本研究探討GH患者氧化應(yīng)激狀態(tài)與細(xì)胞免疫水平，以探討GH的發(fā)病機(jī)制，可用于指導(dǎo)GH的治療、判斷預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集24例GH患者，所有患者來自我院2010年8月至2011年1月性病科門診，診斷符合2000年我國(guó)衛(wèi)生部疾病控制司和全國(guó)性病麻風(fēng)病控制中心聯(lián)合頒布的GH診斷標(biāo)準(zhǔn)。24例GH患者中男16例，女8例，年齡18～40歲(平均23.6歲)，病程2 d～2年，平均病程10.1個(gè)月。患者就診前3個(gè)月內(nèi)均未系統(tǒng)性應(yīng)用免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、皮質(zhì)類固醇制劑。收集24例健康體檢者作為正常對(duì)照，其中男14例，女10例，年齡18～36歲(平均22.9歲)，患者與健康對(duì)照者年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SOD的檢測(cè) 早晨空腹肘靜脈取血2 ml，分離血清待測(cè)。采用透射比濁法，SOD標(biāo)準(zhǔn)試劑合由南京建成生物研究所提供，檢測(cè)方法參照試劑說明書和文獻(xiàn)進(jìn)行［3］。

1.2.2 NK細(xì)胞表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析 取GH患者肝素抗凝血100 ul，加入淋巴細(xì)胞檢測(cè)試劑25 ul，混勻，室溫避光染色20 min;加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，室溫避光放置10 min;1500 r/min離心5 min棄上清液，加磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml，混勻;1500 r/min離心5 min棄上清液，加2%多聚甲醛PBS 500 ml固定，放置4℃ ～8℃冰箱待檢測(cè)。每管加細(xì)胞液100 μl，加入 10 μl抗 CD4 mAb-PerCP，溫室避光放置 15 min;紅細(xì)胞溶解液0.5 μl溶解紅細(xì)胞15 min;破膜劑I、II固定和破膜;加PBS3 ml，1200 r/min離心5 min，棄上清;加細(xì)胞因子抗體，每份標(biāo)本分別加同型對(duì)照IgG1-FITC;溫室避光放置15 min;加 PBS 4 ml，1200r/min;離心 10 min，棄上清;適量 PBS重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè);每份標(biāo)本檢測(cè)1萬個(gè)細(xì)胞結(jié)果經(jīng)Cell Quest功能軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較方差分析后采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

GH患者SOD活力明顯低于健康對(duì)照組(t=-4.14，P=0.0001);NK細(xì)胞的水平明顯低于健康對(duì)照組(t=-2.67，P=0.0133)(見表1);SOD活力與NK細(xì)胞表達(dá)無顯著相關(guān)性(r=-0.02566，P=0.9170)。

表1 GH患者SOD活力與NK細(xì)胞表達(dá)

3 討論

SOD是組織細(xì)胞中清除自由基的主要預(yù)防系統(tǒng)，活力反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，對(duì)有害的超氧陰離子自由基產(chǎn)生特異的歧化反應(yīng)，阻止自由基攻擊核酸、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等生物大分子，使之發(fā)生交聯(lián)或斷裂，保護(hù)細(xì)胞免于損傷［4，5］。SOD與產(chǎn)生的自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷;而信息蛋白迅速傳遞信息，反饋到控制SOD表達(dá)的基因快速作出應(yīng)答，產(chǎn)生足量的SOD，以滿足組織細(xì)胞代謝的需要，當(dāng)這種異常的應(yīng)答一旦長(zhǎng)時(shí)間的存在下去，必然要導(dǎo)致組織細(xì)胞內(nèi)代謝失去平衡，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生異變。NK細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要免疫細(xì)胞，是抗病毒感染的第一道防線［4，5］。在免疫過程中，NK細(xì)胞的存在決定著細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞體細(xì)胞向成熟細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的分化并且控制著記憶T細(xì)胞的形成。MHC-I類分子將感染HSV的細(xì)胞首先呈遞給NK細(xì)胞，NK細(xì)胞直接而迅速地殺滅病毒［2］。最近的研究顯示GH患者外周血NK細(xì)胞數(shù)量減少;此外，患者皮損內(nèi)HSV-2病毒載量與NK細(xì)胞水平呈顯著的負(fù)相關(guān)［6］，提示NK細(xì)胞活性減低，抗病毒作用減弱，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖。癌癥患者NK細(xì)胞活性降低，SOD與過氧化氫酶協(xié)同能夠恢復(fù)患者的NK細(xì)胞活性［7］。

本研究旨在探討GH患者SOD與過氧化氫酶協(xié)同能否恢復(fù)患者的NK細(xì)胞活性，提高患者的免疫水平。研究結(jié)果顯示，GH患者外周血中SOD活力明顯減低，可能與HSV感染消耗了抗氧化物SOD，造成了機(jī)體的氧化應(yīng)激失衡。GH患者NK細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常人群，但SOD活力與NK細(xì)胞數(shù)無顯著相關(guān)性，可能與HSV病毒感染屬于局限性，未引起全身性炎癥反應(yīng)有關(guān)，本研究結(jié)果與易勤等人［7］報(bào)道的結(jié)果基本一致。提示GH患者存在氧化應(yīng)激狀態(tài)失衡、細(xì)胞免疫抑制，抗病毒作用減弱現(xiàn)象;在治療上除了給予抗病毒治療，同時(shí)給予免疫增強(qiáng)劑和抗氧化劑能有效地降低GH的復(fù)發(fā)率。

［1］周文泉，桑紅.生殖器皰疹的流行病學(xué)和診治進(jìn)展.中華男科學(xué)，2003，9(8):611-618.

［2］林路洋，李常興，曹開源，等.單純皰疹-II型病毒感染的皮損部位病毒載量與外周血Th及Tc的相關(guān)性研究.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2009，9(9):994-997.

［3］季健平，吳再彬，劉歧山，等.超氧化物歧化酶超微量測(cè)定法.南京鐵路醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，10(1):27.

［4］馬玉玲，張培菊，李士玉.肝病患者血清LPO SOD檢測(cè)結(jié)果分析.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，21(2):43-44.

［5］史天良，劉維蘭，韓小友，等.焦化工人癌癥高發(fā)與超氧化物歧化酶異常的研究.腫瘤研究與臨床，2000，12(2):101-102.

［6］林路洋，李常興，武明昌，等.生殖器皰疹患者皮損HSV-2病毒載量與外周血細(xì)胞免疫功能的關(guān)系.嶺南皮膚性病科雜志，2008，15(6):327-331.

［7］易勤，張誼芝，張敏.生殖器皰疹患者氧化應(yīng)激與細(xì)胞免疫狀態(tài)的研究.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，37(1):150-151.