腫瘤人源單克隆抗體藥物的研究進展及臨床應用

楊喜佳 綜述 王 平 審校

（云南省第一人民醫院 胸外科，云南 昆明 650032）

自從雜交瘤技術誕生以來，單克隆抗體治療臨床疾病主要經歷了鼠源單克隆抗體，人源化改造過的單克隆抗體和完全的人源單克隆抗體3個階段，三者均能對腫瘤、自身免疫疾病和器官移植產生的排斥反應有效果[1]，其中鼠源單克隆抗體的免疫原性和毒副作用最大[2]，經過人源改造過的抗體可有效的彌補前者的不足，但由于改造過程復雜，工作量大，鼠源性成分去除不徹底等弊端[3]，目前最廣泛使用的是采用抗體庫篩選技術和基因工程小鼠來制備完全的人源單克隆抗體。本文就人源單克隆抗體藥物在腫瘤治療的研究進展和臨床應用做一綜述。

一、人源化改造的單克隆抗體

人源化改造的目的是通過相應的構建策略和高效的表達體系，在不降低抗體親和力和特異性的前提下，最大限度降低鼠源單克隆抗體的免疫原性。最早的改造策略是將人源基因替換鼠源單抗的恒定區，構建嵌合抗體[4]，如最早用于腫瘤治療的美羅華，但由于占改造后的鼠源性抗體30%的可變區仍殘留免疫原性，故人抗鼠抗體反應（HAMA）仍有發生的潛在危險。另1種構建嵌合抗體的策略是將鼠源功能性抗體的可變區基因與人源的κ鏈和重鏈CH1基因進行重組，制備Fab和F(ab')嵌合抗體。除了采用鼠來制備抗體外，也可通過免疫短尾猿猴來獲得單克隆抗體，由于均為靈長目故可直接使用。相對于嵌合抗體，移植抗體的使用更為徹底的降低了鼠源成分，真正的使鼠源抗體人源化得以實現[5]。常用的移植抗體主要有CDR移植抗體和SDR移植抗體2種，前者除了保留了3個互補決定區(CDR)外，其余的均為人源基因，如Ⅰ類抗癌藥物“泰欣生”（人源化程度＞90%）；后者將異源抗體中的特定決定區（SDR）的少數殘基移植到人源基因的相應位置，有效的補救了CDR移植抗體可能引起的抗個體基因型反應。除此之外，還可通過表面重塑和鏈替換來獲得高親和力低免疫原性的人源化抗體。

二、完全的人源單克隆抗體

盡管通過人源化改造鼠源單克隆抗體可以做到降低甚至完全降低免疫原性，但由于其操作復雜，代價高，還要借助電腦模擬等原因[2]，限制了其在腫瘤治療上的推廣和應用。完全的人源單克隆抗體是將生物工程、分子技術和轉基因技術結合起來，制備抗體藥物的1種新方法，其主要包括抗體庫篩選技術和基因工程小鼠。

（一）抗體庫篩選技術：此技術主要包括以下3種，噬菌體抗體庫、合成抗體庫和核糖體展示技術。噬菌體抗體庫的構建主要基于噬菌體表面展示技術，直接從外周血淋巴細胞建立，可以有效的表達諸如Fab，ScFv，DsFV等抗體[6]，如現在已進入臨床Ⅱ/Ⅲ期的CAT-D2E7（治療風濕性關節炎）和CAT-152（青光眼）。通過將抗體的CDR區域設計成為盒式結構，并以通用可變序列作為構建抗體庫的基本結構，配以抗體衍生物插入所需要的位點，構建合成抗體庫，為了防止堿基隨機化造成的氨基酸偏移，采用三聯核苷酸的方式對CDR區域進行預處理。上述2種方法制備的抗體庫庫容量有限，且未經免疫動物的抗體庫產生的抗體親和力不夠，核糖體展示技術在非細胞體系中借助三聯復合體（mRNA+核糖體+抗體蛋白）可獲得大容量和高親和力的抗體。

（二）基因工程小鼠：常用來制備抗體的小鼠主要有人外周血-嚴重聯合免疫缺陷小鼠（hu-PBL-SCID小鼠）、轉基因小鼠和轉染色體小鼠，前者主要通過將人的外周血淋巴細胞移植于SCID小鼠，對移植成功的hu-PBL-SCID小鼠進行免疫反應，即產生人源抗體，但此模型存在一些問題，如需由抗原致敏個體提供外周血淋巴細胞，且要有足夠量的淋巴細胞[7]。轉基因小鼠的鼠抗體生成基因被相應的人基因取代，如采用IL-8，TNFα，EGFR免疫含有人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠可制備高親和力和特異性的抗體。轉基因小鼠由于其免疫系統完整，故抗體可經過正常裝配和成熟過程，具有較高的親和力[5]，但由于轉基因通常存在的細胞突變和獨特序列，會影響人基因序列的功能和結構的完整。同時，也可采用轉染色體小鼠制備完全的人源單克隆抗體，但未見其相應的生物制劑。

三、人源單克隆抗體的表達系統

除了以上提到的轉基因小鼠和噬菌體表達系統外，還包括大腸桿菌表達系統、酵母、昆蟲桿狀病毒、哺乳動物細胞表達系統和植物細胞表達系統。大腸桿菌由于缺乏真核動物的翻譯和加工系統，故適合表達結構簡單的多肽，如Fv，Fab，ScFv等[8]。酵母的種類很多，并且具有較強的啟動子、翻譯加工系統，故在保證蛋白量的同時，還維持可其生物活性，如目前最常使用的甲醇酵母系統。細胞系統由于具有比較穩定的翻譯系統，可使載體比較穩定的表達和遺傳，如動物細胞表達系統（COS細胞、Sp2/0細胞、CHO細胞）和植物細胞表達系統。

四、腫瘤抗體的臨床應用

腫瘤人源單克隆抗體可用于腫瘤的治療，如淋巴瘤、肺癌、乳腺癌及各種惡性腫瘤，其主要的作用方式為殺死腫瘤細胞（CD20，CD52途徑）或者抑制信號通路（Her調控通路），同時將放射物質、細胞毒素和化學物質偶聯，可以增加其作用的靶向性，避免對周圍組織的傷害。

（一）常用的抗腫瘤抗體：利妥昔主要針對CD20抗原的人源化改造的單抗，可與CD20特異的結合，繼而導致B細胞溶解，在不影響原始B細胞的情況下，通過誘導其凋亡，達到抑制B細胞的增殖，殺死淋巴瘤細胞的目。曲妥珠單抗是1種重組型人源化抗體，特異作用Her調控通路，使其調控的HER-2表面蛋白由細胞膜內吞至細胞核，通過抑制HER-2介導的信號傳入，達到治療腫瘤的目的[9]。另外1種人源化、非結合型單抗，阿倫珠可特異的作用于異常的B細胞的CD52抗原，由于CD52幾乎在所有的免疫細胞上都有所分布，繼而通過激活補體（CDC）和抗體（ADCC）依賴性細胞毒性，導致細胞凋亡，達到抗腫瘤的目的。西妥昔是IgG1的單克隆抗體，可與表皮生長因子競爭其受體，一般通過抑制細胞周期或者增加Bax的表達和減少bcl-2來誘導細胞凋亡。由于腫瘤的生長需要大量的營養物質和新生血管的生成，故也可用貝伐單抗，作用于VEGF來阻斷內皮細胞的生長，阻斷腫瘤吸收營養物質。

（二）常用的偶聯劑：腫瘤單克隆抗體有一定的特異性，可以識別靶細胞上的抗原，當其被偶聯某些對細胞有損傷性的物質時，會造成腫瘤細胞的損傷甚至死亡，增強單克隆抗體的抗腫瘤作用。

放射性物質由于具有高能量，因此會造成DNA分子的損傷和斷裂，同時高能量會造成細胞內部水分子的電離，造成氧自由基的生成，導致腫瘤細胞的損傷[10]。免疫毒素偶聯的單抗在到達相應抗原細胞后，會進入細胞內部，通過抑制蛋白合成以及相關蛋白參與的信號通路來殺傷腫瘤細胞。同樣，化學物質也是通過影響靶細胞DNA和蛋白質的合成，來影響腫瘤細胞功能與結構的完整。

隨著生物制劑和分子生物技術的發展，將會有越來越多的低免疫毒性和高親和力的腫瘤單克隆抗體投入臨床腫瘤的治療過程中，基因組學和蛋白質組學揭開了治療性抗體的新時代，在解除人類病患疾苦中扮演者重要的角色。

[1]CHEUNG KC,WONG LG,YEUNG YM.Treatment of CD33 positive refractory acute lymphoblastic leukemia with Mylotarg[J].Leuk Lymphoma,2008,49(3):596-597.

[2]泮結超,石君帆.單克隆抗體的制備及其應用研究進展[J].浙江省醫學科學院學報,2009,3:38-41.

[3]趙曉玲,陳偉強,李靜梅,等.應用核糖體展示技術篩選制備抗TNF-人源抗體的研究[J].細胞與分子免疫學雜志,2009,25 （2）:145.

[4]KASHIF M,QURESHI A,ADILSN,et al.Successful use of rituximab in Evans syndrome and refractory immune thrombocytopenic purpura[J].J Pak Med Assoc,2010,60(1):64-65.

[5]YAMASHITA M,KATAKURAY,SHIRAHATAS,et al.Recent advances in the generation of human monoclonal antibody[J].Cytotechnology,2007,55:55-60.

[6]王業榮,童德文,李立,等.人源化抗體制備及其應用研究進展[J].生物技術通訊,2007,18(4):683-687.

[7]YAMAZAKI S,SUZUKI N,SAITOT,et al.Arapid and efficientstrategy to generate allele-specific anti-HLA monoclonal antibodies[J].J Immunol Methods,2009,343(1):56-60.

[8]MERRILLJT,NEUWELT CM,WALLACE DJ,et al.Efficacy and safety of rituximab in moderately-to-severely active systemic lupus erythematosus:the randomized,double-blind,phase II/III systemic lupus erythematosus evaluation of rituximab trial[J].Arthritis Rheum,2010,62(1):222-233.

[9]BISSONNETTE R,LANGLEY RG,PAPP K,et al.Humanized anti-CD2monoclonal antibody treatment of plaque psoriasis:efficacy and pharmacodynamic results of two randomized,double-blind,placebo controlled studies of intravenousand subcutaneoussiplizum-ab [J].Arch Dermatol Res,2009,301(6):429-442.

[10]METZM,BERGMANN P,ZUBERBIER T,et al.Successful treatment of cholinergic urticaria with anti-immunoglobulin E therapy[J].Allergy,2008,63(2):247-249.