冰凍切片免疫熒光細胞技術的改良

鄭燕璇 王曉鴻 孟曉軍

冰凍切片免疫熒光細胞技術的改良

鄭燕璇 王曉鴻 孟曉軍

由于免疫熒光細胞化學的特異性、快速性和在細胞水平定位的敏感性與準確性，已在病理學診斷方面得到廣泛應用。本文就我科多年的熒光技術實際操作中的經驗體會做個介紹。

冰凍切片;免疫熒光細胞化學;免疫熒光細胞化學技術

免疫熒光細胞化學技術［1］是現代生物學和醫學中廣泛應用的技術之一，由于其特異性、快速性及準確性，在病理學診斷方面已得到廣泛應用，其中以直接法更為簡便、快速。現就我們科多年來在腎穿、皮膚組織免疫熒光操作中的體會做個總結。

1 資料與方法

1.1 材料 腎穿、皮膚組織冰凍切片數張熒光抗體

1.2 方法［2］①將腎穿、皮膚標本置于恒溫冷凍機的冷凍頭上，加少許OCT包埋劑，于冷室內－25℃冷凍切片，厚度要求3～4 um，根據所備抗體切出相應數量的片子［3］;②用冷風機將切片吹干;③將pH7.4的PBS液平鋪于切片上，浸泡2 min;④將稀釋好的熒光抗體滴于切片上，在37℃溫箱內孵育8～10 min;⑤甩去切片上的熒光抗體，用pH7.4的PBS液平鋪浸泡切片2 min;⑥用紙巾擦去組織周邊的液體，滴加緩沖甘油封片。

2 結果

根據顯現的熒光強度來判斷免疫復合物的多少，其觀察結果［4］分為6級:鏡下未見免疫復合物熒光:-;高倍下隱約可見:±;低倍鏡下隱約可見、高倍鏡下可見:+;低倍鏡下可見、高倍鏡清晰可見:++;低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼:+++;低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼:++++。

3 討論

免疫熒光細胞化學［5］是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學技術。

免疫熒光細胞化學分直接法、間接法和補體法，其中直接法是最簡便、快速的方法。用已知特異性抗體與熒光素結合，制成特異性熒光抗體，直接用于細胞或組織抗原的檢查，此法特異性高，在病理學診斷方面得到廣泛應用。

傳統的免疫熒光操作步驟［6］是:①冰凍切片在室溫下電風扇吹干;②pH7.4的PBS液中洗片數次;③熒光素標記的特異性抗體以pH7.4 0.01 mol/L的PBS液稀釋20倍，滴于切片上，在37℃溫箱內孵育15～30 min;④PBS液中洗切片5 min×2次，洗去未與組織結合的抗體;⑤室溫下輕度風干切片;⑥滴加緩沖甘油封片。

我們科在多年實際操作中，對免疫熒光傳統操作方法進行了改良，現介紹如下:①在制備冰凍切片上，皮膚組織與腎穿組織有所不同，因其結構特殊性使得皮膚組織在熒光操作中易掉片，因此在做皮膚熒光時，我們選用了防脫載玻片;②將冰凍切片用PBS液平鋪，浸泡2 min。在以往操作中，我們用PBS液沖洗切片數次(清除組織周邊的包埋劑及未與組織結合的特異性熒光抗體)，不管操作過程如何小心，在觀看熒光時總能見到組織或部分脫落、或部分重疊，影響熒光結果的判斷。在改用PBS液平鋪浸泡切片后，不僅能避免組織脫落、重疊，而且切片經浸泡后，組織周邊的包埋劑清洗干凈，免疫熒光背景清晰;③特異性熒光抗體用pH7.4 0.01 mol/L的PBS液稀釋30倍，尤其在皮膚熒光時，其特異性抗體IgG我們甚至稀釋到120倍，避免抗體濃度過高造成的假強陽性;④熒光抗體與組織孵育時間改為8～10 min，此時觀察熒光效果較好。孵育時間過長時，熒光已開始衰退，影響診斷。經過對免疫熒光傳統操作方法的改良，我們不僅節省了抗體，縮短了操作時間，而且避免了組織脫片及背景著色，提高了染片效果。

［1］ 王伯沄，李玉松.免疫熒光細胞化學技術.病理學技術，2000，381.

［2］ 鄭燕璇，王曉鴻.腎活檢標本的檢查方法及意義.中國實用醫藥，2010，102.

［3］ 王伯沄，李玉松.組織切片技術.病理學技術，2000，88.

［4］ 鄒萬忠，王海燕.腎活檢標本的處理和病理檢查方法.腎活檢病理學，2006，24.

［5］ 王伯沄，李玉松.免疫熒光細胞化學技術.病理學技術，2000，380.

［6］ 王伯沄，李玉松.腎活檢標本的制作技術.病理學技術，2000，949.

519000 中山大學附屬第五醫院病理科

通迅作者:王曉鴻 E-mail:david_20070424@126.com