血液腫瘤自體造血干細胞移植后患者的DC/CIK培養(yǎng)及臨床應用安全性觀察

薛重重 楊麗萍 徐新 許紅雁 韋湘 溫偉英 黃剛

血液腫瘤自體造血干細胞移植后患者的DC/CIK培養(yǎng)及臨床應用安全性觀察

薛重重 楊麗萍 徐新 許紅雁 韋湘 溫偉英 黃剛

目的采用自體造血干細胞移植后完全緩解的血液腫瘤患者的外周血單個核細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴增出樹突狀細胞(dendritic cell DC)/細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cell CIK)，應用DC/CIK細胞免疫治療自體造血干細胞移植后完全緩解血液腫瘤患者，觀察其不良反應。方法采集10例血液腫瘤自體造血干細胞移植后完全緩解患者的外周血單個核細胞，在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4、TNF-α等誘導產(chǎn)生DC，經(jīng)IFN-γ、抗CD3單抗、IL-2等誘導產(chǎn)生CIK，觀察其細胞形態(tài)及臨床應用的不良反應并分析其細胞免疫表型。結(jié)果培養(yǎng)產(chǎn)生形態(tài)學典型的DC/CIK。誘導成熟的DC經(jīng)流式細胞儀分析顯示CD80、CD83、CD86、CD1a等陽性細胞比率大幅上升。CIK隨著培養(yǎng)時間的延長，CD3+CD56+、CD3+CD8+雙陽性細胞的比率亦大幅度上升。在DC/CIK細胞免疫治療過程中，3例患者DC注射部位出現(xiàn)輕微疼痛，可自行緩解。2例患者輸注CIK后出現(xiàn)低熱，持續(xù)時間2～6 h，可自行消退。4例患者輸注完CIK后出現(xiàn)乏力，約2 h可自行緩解。結(jié)論自體造血干細胞移植后完全緩解患者的外周血單個核細胞對DC/CIK的培養(yǎng)不受影響。DC/CIK細胞免疫治療自體造血干細胞移植后完全緩解的血液腫瘤患者，安全性好，不良反應少。

細胞免疫治療;自體造血干細胞移植;血液腫瘤

DC和CIK是腫瘤免疫治療的兩個重要部分，前者識別抗原、激活獲得性免疫系統(tǒng)，后者通過發(fā)揮自身細胞毒性和分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，二者聯(lián)合確保了一個高效和諧的免疫體系。將具有強大腫瘤抗原提呈能力的DC和具有高效殺傷活性的CIK聯(lián)合應用于治療惡性腫瘤，有助于增強腫瘤患者T細胞免疫能力，起到抗腫瘤作用［1］。基于以上DC/CIK的生物學特性，我們在建立DC/CIK培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，開展了DC/CIK過繼細胞免疫治療血液腫瘤自體造血干細胞移植后緩解患者的臨床安全性研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 10例患者為汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院血液內(nèi)科住院并確診的血液腫瘤自體造血干細胞移植后緩解的患者。男4例，女6例，平均年齡48歲(33～63歲)，其中急性髓細胞白血病(Acute myelocytic leukemia，AML)3例，非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin lymphoma，NHL)5例，多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)2例。

1.2 實驗材料 COBE Spectra血細胞分離機(美國COBE公司);SANYO MCO-18AICUV CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);倒置顯微鏡(廣州粵顯光學儀器有限責任公司);FACS-Calibuer流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司);RPMI 1640培養(yǎng)基、小鼠抗人CD3單克隆抗體(北京博特納生物科技有限公司);GM-CSF(遼寧衛(wèi)星生物制品研究所);IL-4、TNF-α(美國Peppotechinc公司);IFN-γ(上海克隆生物高技術(shù)有限公司);IL-2(北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司)。

1.3 DC/CIK細胞的培養(yǎng) 在患者簽署知情同意書以后，用血細胞分離機采集患者的外周血單個核細胞，經(jīng)淋巴細胞分離液離心獲得單個核細胞，讓細胞貼壁生長2 h。將獲得患者外周血單個核細胞中的貼壁細胞調(diào)細胞密度為5×106/ml進行培養(yǎng)。培養(yǎng)體系:GM-CSF 1000 u/ml、IL-4 500 u/ml、TNF-α500 u/ml，每3 d更換新鮮培養(yǎng)液，誘導培養(yǎng)時間為7～13 d。CIK的體外培養(yǎng):將獲得患者外周血單個核細胞中的懸浮細胞調(diào)細胞密度為2×106/ml進行培養(yǎng)。培養(yǎng)體系:CD3單抗50 ng/ml、IFN-γ2000 u/ml、IL-2 1000 u/mll，每3 d 更換新鮮培養(yǎng)液，誘導培養(yǎng)時間為9～13 d。

1.4 DC/CIK細胞的回輸 經(jīng)汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院倫理委員會批準，DC/CIK經(jīng)過質(zhì)檢合格(包括細菌、霉菌培養(yǎng)陰性，細胞活性大于95%等)進行細胞免疫治療。DC經(jīng)皮下注射(雙頸部、腋下、腹股溝淋巴結(jié)區(qū)域共6個部位)。CIK經(jīng)靜脈回輸。

1.5 DC/CIK細胞免疫表型 DC檢測:CD80、CD83、CD86、CD14、CD1a、HLA-DR。CIK 檢測:CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD3+CD4+。

1.6 不良反應的觀察 DC/CIK治療中密切觀察不良反應，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、胸悶、心悸等;治療過程中所有患者隔日檢查一次血常規(guī)、大小便常規(guī)、肝腎功能及心肌酶等，每周檢查一次心電圖。

1.7 統(tǒng)計學方法 檢測數(shù)據(jù)以均值±標準差(±s)表示，采用t檢驗用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 DC/CIK細胞培養(yǎng)過程中的質(zhì)量控制 每例患者的DC/CIK細胞培養(yǎng)過程中均進行多次的細菌、霉菌的檢查。結(jié)果所有樣本檢測均為陰性，確保細胞培養(yǎng)及細胞回輸?shù)陌踩?/p>

2.2 不同培養(yǎng)時間DC/CIK免疫表型的變化 10例患者的DC/CIK細胞免疫表型隨培養(yǎng)時間的變化而變化，誘導成熟的DC經(jīng)流式細胞儀分析顯示培養(yǎng)第13天，CD80的平均陽性率為94.83%、CD83的平均陽性率為80.84%、CD86的平均陽性率為91.70%、CD1a的平均陽性率為81.52%、HLADR的平均陽性率為95.42%。CIK培養(yǎng)后CD3+CD56+、CD3+CD8+雙陽性比率明顯升高，培養(yǎng)的第13天平均陽性率分別為48.05%和65.71%，而CD3+CD4+雙陽性比率則明顯下降。

2.3 不同培養(yǎng)時間DC/CIK細胞形態(tài)的變化 DC培養(yǎng)第2天細胞體積開始變大;3 d左右細胞開始出現(xiàn)變形，拉長呈梭形及放射狀等各種不規(guī)則的形態(tài)，部分細胞開始懸浮;培養(yǎng)7 d左右，集落明顯增多，有更多的細胞處于輕貼壁狀態(tài);培養(yǎng)9 d左右大部分細胞開始懸浮，形態(tài)不規(guī)則，鏡下可見大量具有毛刺狀突起的細胞，為典型的DC形態(tài)。CIK培養(yǎng)第5天左右開始倍增，細胞體積明顯增大，呈現(xiàn)母細胞化，并成簇生長;在培養(yǎng)的第7天，細胞數(shù)量明顯增多，細胞團更大，懸浮在培養(yǎng)液中。

2.4 DC/CIK細胞治療的不良反應 DC皮下注射過程中、CIK回輸后4例患者無不適，3例患者DC注射部位有輕微疼痛，10～15 min后可自行緩解。CIK回輸后1例患者出現(xiàn)低熱、乏力癥狀，1 h后緩解，1例患者出現(xiàn)低熱持續(xù)2 h左右，可自行緩解，3例患者出現(xiàn)乏力1 h后可自行緩解，所有患者回輸中及回輸后均未出現(xiàn)寒戰(zhàn)、胸悶等不適，亦未出現(xiàn)皮疹等過敏反應。在治療過程中，患者一般情況良好，無肝腎功能損害，心肺功能亦無影響。

3 討論

DC和CIK是腫瘤免疫治療的兩個重要部分，將DC與CIK聯(lián)合起來治療血液腫瘤，將有助于解除部分腫瘤患者T細胞的免疫能力，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。

未成熟DC在外周組織捕獲抗原后，需經(jīng)引流淋巴管遷移至局部淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)T細胞區(qū)與初始型T細胞接觸并活化初始型T細胞，因此，DC的輸注途徑可能決定了細胞免疫能否發(fā)生及發(fā)生的強弱。動物實驗表明，皮下和皮內(nèi)注射DC比靜脈注射更易誘導細胞毒性T淋巴細胞反應［2］。Fong等［3］將體外至敏的DC分別采取皮內(nèi)、淋巴管及靜脈三種不同的途徑輸入前列腺癌患者體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)三種途徑雖然均能誘導抗原特異性T細胞免疫應答，但反應程度各不相同。經(jīng)皮內(nèi)和淋巴管途徑能產(chǎn)生高水平的TNF-γ，更易誘導Th1應答。目前認為靜脈注射有利于DC在體內(nèi)的分布，但也可能大部分被肝臟清除和抑制，皮下淋巴結(jié)區(qū)域注射有利于DC和T細胞的接觸。岳欣等［4］研究不同輸注途徑對CIK治療后的體內(nèi)分布的影響，動物實驗表明CIK輸入體內(nèi)后，迅速分布至肝、脾、腎、肺、胃、腸等器官，其中肝、脾、腎的分布濃度最高，CIK輸入體內(nèi)的早期，尾靜脈注射途徑中肺最先達到分布高峰，而腹腔注射途徑中腹腔內(nèi)器官率先達到分布高峰。研究表明，CIK體內(nèi)分布的廣泛性表明它可以用于身體各部位惡性腫瘤的治療，而血管輸入途徑可能更適于血供豐富器官腫瘤的治療，而體腔輸入途徑也許更適合于體腔內(nèi)惡性滲液或局限病灶的治療。

到目前為止未見DC應用于腫瘤的臨床免疫治療出現(xiàn)明顯的不良反應報道。Reichart等［5］對12例HSCT后多發(fā)性骨髓瘤患者使用Id致敏的DC進行免疫治療，所有患者治療過程中及治療后無明顯毒副反應，治療后2例CR患者產(chǎn)生了Id特異性的T細胞增生性免疫反應并且一直保持CR，其中1例HSCT無效的患者未經(jīng)進一步化療，只接受DC免疫治療，目前仍存活達20個月。張樂萍等［6］臨床應用CIK與IL-2聯(lián)合治療兒童ALL微小殘留病灶(MRD)，結(jié)果顯示:14例患者應用CIK/IL-2治療，輸注過程中無1例出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱、過敏。對心肺功能影響不大;輸注后外周血白細胞略有升高，血紅蛋白和血小板無變化，說明CIK具有安全性。治療組隨訪5～33個月無1例復發(fā)，生存時間超過30～54個月，且骨髓形態(tài)學和MRD檢測均為陰性。對照組8例復發(fā)死亡，兩組復發(fā)率比較差異有統(tǒng)計學意義。石永進等［7］應用自體CIK對5名惡性血液系統(tǒng)腫瘤患者進行治療，回輸時患者未出現(xiàn)明顯毒副反應，回輸后行心、肝、腎等器官功能檢測未出現(xiàn)新的異常。隨訪22～26個月，其中APL患者CIK治療前PML-RARα融合基因為陽性，CIK回輸后轉(zhuǎn)為陰性，2年后檢查仍為陰性;除AML M4患者復發(fā)外，其他患者均正常，未見復發(fā)。

基于以上腫瘤細胞過繼免疫治療的研究進展，我們開展DC/CIK過繼細胞免疫治療自體造血干細胞移植后完全緩解血液腫瘤的臨床安全性研究，觀察其治療過程中及治療后的不良反應。臨床研究在DC/CIK在治療過程中及治療后主要的不良反應是低熱、疲乏無力、注射部位輕微疼痛等。低熱多發(fā)生在輸注完2 h左右，持續(xù)2～6 h左右，可自行緩解，疼痛亦可自行緩解。DC/CIK治療后患者的外周血、肝腎功能、心肌酶等血液生化指標不受治療影響。在治療過程中觀察患者生命體征平穩(wěn)，無危及生命的并發(fā)癥出現(xiàn)。未見食欲減退等癥狀，患者精神狀態(tài)較好。DC/CIK治療不良反應少，臨床治療是安全的。

［1］ 隋承光，孟凡東，王曉華，等.CIK的制作及對不同腫瘤細胞株體外抗腫瘤作用的研究.中國醫(yī)科大學學報，2005，34(3):210.

［2］ Jonathan S.Serody，Edward J.Collins，Roland M.Tisch，et al.T Cell Activity After Dendritic Cell Vaccination Is Dependent on Both the Type of Antigen and the Mode of Delivery.The Journal of Immunology，2000，164:4961-4967.

［3］ Lawrence Fong，Dirk Brockstedt，Claudia Benike，et al.Dendritic Cell-Based Xenoantigen Vaccination for Prostate Cancer Immunotherapy.The Journal of Immunology，2001，167:7150-7156.

［4］ 岳欣，李慧，于津浦，等.不同輸注途徑對CIK細胞治療后的體內(nèi)分布的影響.中國免疫學雜志，2007，23(3):224-228.

［5］ Reichart V L，Okada C Y，Liso A，et al.Idiotype vaccination using dendritic autologous periphereal blood stem cell transplantion for multipe myeloma a feasibility study.Blood，1999，9397:2411-2419.

［6］ 張樂萍，陸愛東，童春容，等.細胞因子誘導的殺傷細胞/白細胞介素2治療兒童急性淋巴細胞白血病微小殘留病灶療效觀察.實用兒科臨床雜志，2003，18(3):185-186.

［7］ 石永進，虞積仁，朱平，等.細胞因子誘導殺傷(CIK)細胞的大容量擴增與殺傷活性觀察.生物醫(yī)學工程學雜志，2001，18(1):94-96.

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