欖香烯對K562細胞株的體內外抑制作用

莊彥，徐希，章圣輝，俞康

（溫州醫學院附屬第一醫院，浙江 溫州 325000，1.血液科；2.醫學科學研究所）

欖香烯（elemene）是從姜科植物溫郁金（溫莪術，curcuma Wenyujin）中提取的半萜烯類化合物，其主要成分是為β-欖香烯（化學名：1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙基環己烷；分子式：C15H24，分子量：204），是我國自行開發研制的II類非細胞毒性抗腫瘤藥[1]，由于其抗瘤譜廣[2]，療效確切，能夠逆轉腫瘤多藥耐藥并具有鎮痛[3]、放化療增敏作用[4]，且不良反應輕微，無骨髓抑制，無肝腎損害，因而越來越多的在腫瘤的臨床治療中獲得應用。本實驗通過欖香烯對慢性粒細胞白血病急性髓系變的K562細胞株體外和體內的抑制作用，探討其用于髓系白血病治療的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器：K562細胞株由本室保存；欖香烯乳注射液由大連金港制藥有限公司提供（0909251）；胎牛血清、RPMI1640購自美國GIBCO公司；AnnexinV/PI購自美國invitrogen公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自日本同仁化學研究所；DAPI染液購自碧云天生物研究所；FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；熒光顯微鏡OLYMPUS BX41；全自動酶標儀ELX400。

1.1.2 實驗動物：SPF 級SCID Beige小鼠，6～8周齡，體重為16～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2006-0009。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：K562細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每2 d換液1次，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞生長抑制試驗：K562細胞以1.0×104個/孔接種到96孔板中，使用10、20、30、40μg/mL的欖香烯處理，每孔總體積為100μL。各個濃度均設6個復孔，另設空白對照孔和調零孔。在培養箱分別培養24、48、72 h后，各取出1塊96孔板，每孔加入CCK-8溶液10μL，混勻后37 ℃培養箱繼續孵育3 h，酶標儀450 nm波長測吸光度（A450）。生長抑制率=（對照孔A值-實驗孔A值）/對照孔A值×100%。

1.2.3 Annexin V/PI熒光標記法檢測細胞凋亡：將1.0×105個/mL的細胞接種于6孔板上，使用10、20、30、40、50μg/mL的欖香烯處理48 h。收集細胞，PBS洗2次，按AnnexinV-FITC/PI 試劑盒說明書操作，采用Cellquest 3.2分析軟件獲取和分析結果。

1.2.4 DAPI染色分析核形態：前期處理同細胞凋亡檢測，48 h后收集細胞，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定，細胞團滴片，風干，加入10μL的DAPI染液染色15 min，封片，使用免疫熒光顯微鏡進行觀察（波長為340～380 nm，放大倍數為1000倍）。

1.2.5 體內抑瘤實驗：取16只SCID小鼠，分別標記，將一側背部剃毛用于細胞皮下接種。K562細胞接種前2 d，每天予腹腔注射環磷酰胺2 mg/只，共2 d。調整K562細胞濃度為6×107個/mL，每只小鼠于背部皮下接種0.1 mL。接種后第4天，將小鼠隨機分為正常對照組和欖香烯組，每組8只。欖香烯組每天腹腔注射欖香烯125 mg/kg（約2.5 mg/只），對照組每天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，連續注射14 d，每隔2 d用游標卡尺測定腫瘤長短徑，按下式計算腫瘤體積：腫瘤體積=（長徑×短徑2×0.52）。于第24天處死小鼠，剝離瘤體，稱量，計算腫瘤生長抑制率IR：IR =（1-給藥組平均瘤質量）/正常對照組平均瘤質量×100%。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件，不同藥物濃度組間比較采用完全隨機設計的方差分析。

2 結果

2.1 欖香烯體外抑制K562細胞增殖 結果見表1、圖1，欖香烯對K562細胞具有明顯的生長抑制作用，并呈量效和時效關系。40μg/mL的欖香烯作用24、48、72 h的抑制率分別為45.1%、63.1%、89.1%，與對照組相比，差異有統計學意義（P<0.01）。

表1 β-欖香烯對人髓系白血病K562細胞的增殖抑制作用（±s，n=6）

表1 β-欖香烯對人髓系白血病K562細胞的增殖抑制作用（±s，n=6）

欖香烯濃度（mg/L）24 h抑制率（%）0 10 20 30 40吸光度0.555±0.045 0.490±0.022 0.477±0.032 0.424±0.018 0.305±0.030 48 h 72 h抑制率（%） 吸光度1.172±0.034 1.026±0.114 0.947±0.096 0.315±0.080 0.128±0.006吸光度0.890±0.054 0.782±0.051 0.744±0.055 0.522±0.045 0.328±0.023 11.6 14.0 23.5 45.1抑制率（%）12.1 16.4 41.3 63.1 12.4 19.2 73.1 89.1

圖1 不同濃度和作用時間下欖香烯對K562細胞的生長抑制作用

2.2 細胞凋亡的形態學 未經欖香烯處理的細胞，核膜光滑、核質均一；經不同濃度欖香烯處理48 h后的細胞核具有凋亡細胞核的特征性核形態，細胞核呈折縫樣，染色質出現濃縮，核膜破裂，染色質固縮，細胞核裂解為碎塊等。見圖2。

2.3 欖香烯誘導K562細胞凋亡 欖香烯作用48 h后，Annexin V-FITC/PI雙染后流式細胞儀檢測結果顯示，10、20、30、40、50μg/mL欖香烯早期細胞凋亡率分別為（2.38±1.04）%、（2.98±1.36）%、（4.99±1.96）%、（18.03±2.45）%、（53.58±4.34）%。與陰性對照組的（1.10±0.47）%相比，差異均有統計學意義（P<0.05），并呈劑量依賴性。見圖3。

圖2 經不同濃度欖香烯處理K562細胞DAPI染色結果

圖3 欖香烯對K562細胞作用48 h的凋亡率（%）

2.4 欖香烯體內抑制K562細胞增殖 接種4 d后皮下可見較均一的瘤狀突起，并隨時間延長不斷長大。16只SCID鼠均移植成功，經觀察和測量，經125 mg/kg欖香烯處理的小鼠腫瘤生長較對照組明顯減緩（見圖4），至觀察期末，兩組均無小鼠死亡。接種24 d后將小鼠處死小鼠，將剝離的瘤體稱重，對照組瘤重均值為（0.341±0.074）g，實驗組瘤重（0.095±0.031）g，按公式計算的腫瘤抑制率為72.1%。

圖4125 mg/kg欖香烯對K562細胞株的體內抑制作用

2.5 病理學觀察 經HE染色后于光鏡下觀察，實驗組腫瘤組織中細胞出現大量壞死，腫瘤中組織內血管分布較少，對照組中，腫瘤細胞形態清晰，壞死較少，血管豐富，兩組對比差異明顯。見圖5-6。

圖5 實驗組腫瘤組織病理切片(HE，×200)

圖6 對照組腫瘤組織病理切片（HE，×200）

3 討論

目前，血液系統的惡性腫瘤治療仍以細胞毒藥物化療為主要方式，腫瘤耐藥和化療對重要器官損傷是臨床經常遇到的難題。欖香烯作為我國自主研發的二類非細胞毒性抗腫瘤新藥，具有逆轉腫瘤多藥耐藥、抑制腫瘤血管生成、放化療增敏和調節機體免疫的功能，而且還具有骨髓抑制較輕和能透過血腦屏障的優點，具有較廣闊的應用前景。

本實驗表明，30μg/mL香烯對K562細胞的增殖開始出現明顯的抑制作用，隨著濃度的增加和作用時間的延長，增殖的抑制作用逐漸明顯，顯示出明顯的劑量效應和時間效應依賴關系。50μg/mL欖香烯處理K562細胞48 h后，凋亡細胞數明顯增多，達53.58%，并存在劑量依賴關系。DAPI染色進一步從形態學上證明了欖香烯能誘導K562細胞凋亡，經欖香烯暴露48 h后，細胞核內的染色質呈高度濃縮、邊緣化，產生細胞核碎片，形成凋亡小體。對比相關文獻，鄒麗娟等[5]亦發現欖香烯其能誘導K562細胞凋亡，在40μg/L作用48后，凋亡發生率達58.4%，并能抑制細胞內Bcl-2表達。陸羨等[6]的研究顯示了β-欖香烯能夠阻滯K562細胞從G1期向S期轉化，30μg/L作用48 h后，凋亡率為（34.3±2.8）%。均提示β-欖香烯對K562細胞能產生增殖抑制作用并誘導其凋亡。此外，欖香烯注射液對人白血病HL-60、NB4[7]細胞株、宮頸癌Hela細胞株、肝癌Hca-F25/CL-16A3細胞株及喉癌Hep-2、肺癌A549細胞株等增殖均有顯著的抑制作用，且對多藥耐藥（MDR）的細胞株如K562/ADM、乳腺癌MCF-7/ADM、胃癌SGC7901/VCR、腦膠質瘤U251/ADM能夠逆轉其耐藥性[8]，顯示其具有不但具有較廣的抗瘤譜、良好的抑瘤效果，還具有逆轉腫瘤多藥耐藥的作用。

本研究同時通過腹腔給藥，對皮下荷瘤的SCID小鼠的進行處理后發現， 腹腔注射125 mg/kg欖香烯的實驗組小鼠腫瘤生長較注射0.9%氯化鈉溶液的空白對照組明顯減緩，且給藥的耐受性較好，連續14 d未引起小鼠死亡，但注射后能觀察到小鼠萎靡少動，排便增多，便溏，于數小時內恢復，對攝食影響不明顯，考慮與欖香烯對腹膜的刺激有關。在觀察期內，兩組小鼠體重均有增加，但無明顯差異。兩組在實驗終點剝離瘤體，瘤重差異明顯，腫瘤抑制率達72.1%。HE染色也證明經實驗組小鼠瘤體壞死程度、纖維化程度均高于對照組，兩者相比差異有統計學意義。與曹忠勝等[9]將欖香烯作用于人喉鱗癌Hep-2細胞株的裸鼠皮下移植模型，抑瘤率達52.24%，且無明顯不良反應的結果相符。通過動物實驗，進一步證明了欖香烯對K562白血病細胞在體內也具有較強抑制作用，且藥物安全性和耐受性較好。

在欖香烯的安全性方面，楊驊等[10]研究了其對正常人外周血白細胞的體外抑制作用，結果顯示其IC50為254.3μg/mL，王茜莎等[11]的研究亦顯示欖香烯對小鼠骨髓和人正常肝胚胎細胞無抑制，故顯示其具有較低的細胞毒性。在臨床治療白血病方面，亦有一些嘗試，如陳潔等[12]用欖香烯聯合化療治療難治性老年白血病23例，結果顯示總有效率為65.2%，感染、心血管事件、肝腎功能損害及出血的發生率均較低，與對照組相比差異有統計學意義。余惠[13]研究7例急性白血病患者，以單用或先單用欖香烯，再予原先已無效的化療方案治療后，其骨髓及外周血原始細胞均有不同程度的下降，總有效率達57%，耐受性好且不良反應輕微，顯示了欖香烯在臨床治療白血病的可行性及有效性。

綜上所述，本研究評價了欖香烯單藥對K562細胞的體內外作用，顯示其在體外具有明顯的促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖的作用，且在體內能夠抑制K562荷瘤小鼠的瘤體生長，抑瘤率達72.1%，在連續給腹腔給藥下未出現小鼠死亡，顯示其有較好的安全性。通過研習相關文獻，顯示出欖香烯逆轉多藥耐藥、放化療增敏、骨髓抑制輕微等諸多優點，預示欖香烯在治療髓系白血病，特別是老年白血病以及難治性白血病方面有良好前景。

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