二苯乙烯苷對老齡大鼠腦缺血再灌注后HIF-1α及EPO表達的影響

袁惠瓊， 楊 杰， 曾 進， 郭榮靜

腦缺血再灌注損傷后，病灶分為缺血中心區和缺血半暗帶區。缺血中心區的神經細胞在缺血幾分鐘后就呈不可逆性壞死;而缺血半暗帶區神經細胞的主要死亡形式是遲發性的細胞凋亡，在一定條件下其死亡趨勢是可以逆轉的，因此缺血半暗帶成為腦梗死治療的關鍵部位。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是在缺血缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物及人體的一種轉錄因子。近年來，多項證據顯示，HIF-1α在腦缺血再灌注腦損傷中具有神經保護作用［1～3］，而HIF-1α的這種保護作用是通過對其相應的靶基因調節而產生的。促紅細胞生成素(EPO)是其下游一個靶基因編碼的蛋白，EPO可以通過抑制N-甲基-D-天冬氨酸介導的細胞凋亡和神經損傷起到腦保護作用［4］。

有研究［5］表明腦缺血預處理可以誘導內源性HIF-1α及EPO的表達，起到腦保護作用。二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbene glucoside，TSG，2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)系中藥何首烏的活性成分。研究［6］發現TSG對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，但其具體機制不明。本研究通過觀察TSG對腦缺血-再灌注損傷大鼠腦內HIF-1α及EPO蛋白表達的影響，探討TSG的腦保護作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD老齡大鼠72只，體質量400～500g，月齡12個月(購自中南大學湘雅醫學院實驗動物中心)。

1.2 藥物與試劑 TSG由湖南中醫研究所制劑室提供，經高效液相色譜法提取分離純化測定其純度為70%，4℃冰箱保存，臨時制備成12mg/ml溶液備用;兔抗鼠HIF-1α多克隆抗體購自美國Millipore公司;兔抗鼠EPO多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;SABC即用型免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物工程有限公司。

1.3 主要儀器 石蠟切片機購自Leica公司;生物光學顯微鏡照相機購自日本Olympus;HPIAS-1000彩色病理圖像分析系統購自武大影像工程公司。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 400～500g清潔級健康雄性SD老齡大鼠72只，月齡12個月，隨機分為3組，即對照組、模型組、TSG組，每組按照缺血2h再灌注后處死的時間點分為6h、24h、48h、7d 4個亞組，每個亞組 6 只。TSG 組采用劑量為 60mg/kg/d［6，7］，每天上午定時灌胃，給藥體積為5ml/kg，模型組以相同體積的生理鹽水替代，第7天灌胃后1h行線栓法制備大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，手術后每日上午仍定時灌胃，直至處死。

2.2 動物模型制作 參考Longa［8］的線栓法制備局灶性大腦中動脈腦缺血模型，具體步驟為:以0.35 ml/100g劑量給予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，動物麻醉成功后，作頸部正中切口，分離皮下組織，找到右側頸動脈鞘，游離右側頸動脈及分支，確認頸總動脈、頸外動脈后分別予以結扎，在頸內動脈近端夾上動脈夾，在頸總動脈遠端作血管切口，將遠端鈍化的0.260 mm單絲尼龍釣魚線(預先已于18mm、20mm、22mm長處作好刻度標記，并用10%多聚賴氨酸浸泡)自動脈切口插入，松開動脈夾，直視下尼龍線自頸總動脈切口處插入約18±5mm阻塞大腦中動脈入口，然后縫合皮膚留2cm線頭，栓線尾端部分固定于皮膚上。尼龍線保留120min，缺血結束后拔出一定長度尼龍線(不可完全拔出)，形成再灌注。手術過程中予以照射燈保持體溫在37℃ ±0.5℃，并監測肛溫、呼吸及心率。手術結束后將動物單獨置于籠中，直至蘇醒后予以評分。對照組插線深度為8～10mm，其余操作相同。

2.3 神經功能評分 根據Longa 5級標準評分法，動物蘇醒后開始首次評分，直至動物死亡或被處死。0分:正常，未見任何神經功能缺損;1分:垂直提尾時對側前爪不能伸直;2分:行走時身體向對側旋轉;3分:行走時身體向對側跌倒;4分:不能自發行走或意識喪失。根據首次評分為0分和4分及有呼吸困難、提前死亡及處死時發現有蛛網膜下腔出血的大鼠均棄之不用。此外對于手術中出血過多的動物也棄去。

2.4 取材 腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉動物，經心臟灌注4%多聚甲醛約300ml至大鼠四肢強直僵硬，斷頭將腦完整取出，置于4%多聚甲醛室溫下固定24h，取自額極4～11mm之間的腦組織，脫水透明后石蠟包埋切片，切片厚度(5μm)，備用。

2.5 免疫組織化學 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水稍沖洗，3%H2O2滴加在載玻片上室溫靜置15min(滅活內源性過氧化物酶)，熱修復抗原，滴加5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液37℃孵育30min，加抗HIF-1α兔多克隆抗體(1∶100)或抗EPO兔多克隆抗體(1∶50)，37℃孵育1h后4℃過夜，充分洗滌后，滴加生物素化山羊抗兔IgG抗體50μl，37℃孵育30min，充分洗滌后，滴加鏈霉素親和素-生物素復合物(SABC)50μl，37℃孵育 30min，充分洗滌后，DAB顯色，在顯微鏡下掌握染色程度，蘇木精輕度復染核，脫水、透明、封片、鏡檢。陰性對照采用PBS取代一抗，余同上操作，均為陰性結果。

2.6 結果觀察 光學顯微鏡下選擇細胞中出現棕黃色顆粒者為陽性細胞。采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統對切片進行圖像分析。每個時間點每只大鼠每個指標隨機選取2張切片，每張切片隨機選取頂葉缺血半暗帶5個不重復視野，高倍鏡下(×400)觀察計數每個視野中陽性細胞數，取均數作為各時間點該指標陽性細胞數。

3 結果

3.1 動物模型評價 動物麻醉后約2h～2.5h清醒，對照組動物清醒后未見明顯的神經功能缺損的癥狀和體征，術后進食、活動好。造模動物中2只死于蛛網膜下腔出血，1只死于大面積腦梗死，2只未觀察到神經功能缺損，其他動物于清醒后出現精神萎靡，反應遲鈍，活動及進食減少，左側前肢無力，提尾時左前肢屈曲左前肢不能抓桿，爬桿困難，行走時身體向左側偏斜或旋轉，甚至向左側跌倒。TSG治療組除體重輕度不增外，未見食欲下降、腹瀉、精神萎靡等副作用。首次神經功能評分:0分2只;1分13只;2分25只;3分8只。模型總成功率為88.58%，總死亡率為6.25%。與模型組比較，TSG治療組大鼠神經功能缺損評分除手術后6h外，其余各時間點均明顯降低(P＜0.05，見表1)。

3.2 HIF-1α的實驗結果 TSG對大鼠腦缺血再灌注后缺血周邊區頂葉皮質HIF-1α蛋白表達的影響結果如表2所示，缺血再灌注后6h缺血周邊區頂葉皮質神經元HIF-1α蛋白陽性表達明顯增加，24h表達最明顯，7d仍見表達。形態學上多數陽性細胞體積較大，呈典型神經元形態，細胞輪廓清晰，細胞漿、細胞核內均有陽性表達，主要為胞漿著色，呈棕黃色。與假手術組比較，缺血各組HIF-1α的表達顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，TSG治療組再灌注各時間點陽性細胞的表達數量均顯著增多(P ＜0.01，見表2、見圖1～圖3)。

3.3 EPO的實驗結果 缺血再灌注后6h缺血周邊區頂葉皮質神經細胞EPO的表達明顯增加，再灌注48h增加最明顯，再灌注7d仍有較多表達EPO的細胞。EPO蛋白陽性細胞主要為胞漿著色，呈棕黃色。TSG治療組再灌注6h、24h、48h及7d陽性表達的細胞數量均顯著增多(P＜0.01，見表3、見圖4～圖6)。

3.4 HIF-1α與EPO相關分析 取對照組、模型組及TSG干預組各時間點陽性細胞數分別對應進行雙尾Pearson’s相關檢驗，HIF-1α與EPO蛋白陽性表達之間的相關系數為0.978，兩者呈正相關(P＜0.01)。

表1 缺血各組大鼠神經功能評分的比較±s分，n=6)

表1 缺血各組大鼠神經功能評分的比較±s分，n=6)

與模型組比*P＜0.05

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表2 各組大鼠缺血側頂葉皮質HIF-1α蛋白表達的比較(±s，陽性細胞數，n=6)

表2 各組大鼠缺血側頂葉皮質HIF-1α蛋白表達的比較(±s，陽性細胞數，n=6)

與對照組比較*P＜0.01;與模型組比較#P＜0.01

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表3 各組大鼠缺血側頂葉皮質EPO蛋白表達的比較(±s，陽性細胞數，n=6)

表3 各組大鼠缺血側頂葉皮質EPO蛋白表達的比較(±s，陽性細胞數，n=6)

與對照組比較*P＜0.01;與模型組比較#P＜0.01

再灌注時間 對照組 模型組 TSG組6h 24h 48h 7d 28.60 ±2.4927.75 ±2.0628.48 ±1.9929.81 ±4.1063.62 ±1.03*68.58 ±1.52*76.95 ±0.58*44.98 ±1.73*73.80 ±1.69*#77.45 ±1.69*#81.85 ±0.86*#58.27 ±2.94*#

4 討論

HIF-1α是調節氧穩態平衡的主要調節因子，在常氧條件下哺乳動物及人體細胞中也有低水平表達，但易于經泛肽-蛋白酶體途徑降解，且在常氧條件下HIF-1α的轉錄活性被抑制。腦缺血缺氧時，腦組織細胞內HIF-1α的降解受到抑制，細胞質內的HIF-1α積聚增多并轉入細胞核內與HIF-1β結合形成HIF-1異二聚體，HIF-1α的C末端轉錄激活結構域進一步與低氧反應基因的啟動子-增強子中的低氧反應元件結合，啟動低氧反應基因的轉錄，誘導靶基因的表達。近年來在對HIF-1α與缺氧缺血-再灌注腦損傷的研究中發現［8］，HIF-1α主要通過促紅細胞生成素(EPO)、血管內皮生長因子(VEGF)、腎上腺髓質素(ADM)、葡萄糖轉運蛋白1(GLUT-1)的表達起到腦保護作用。Bergeron等［9］通過對大鼠腦缺血模型的研究發現，缺血后8h，在缺血半暗帶，HIF-1αmRNA及其靶基因表達增加，并在缺血后19h和24h表達進一步增加。Jin等［10］在大鼠全腦缺血模型中發現，缺血15min缺血腦皮質邊緣和海馬的神經元表達HIF-1α，在再灌注4～72h期間持續表達。本實驗結果顯示HIF-1α在缺血再灌注6h后表達增加，再灌注24h達高峰，與以上報道相一致。TSG干預組各時間點HIF-1α表達較模型組顯著增加，說明在缺血再灌注損傷的腦組織中，TSG能增加HIF-1α的表達。

EPO和其受體(EPOR)在嚙齒類動物和人類腦組織中皆有表達，而且廣泛分布于海馬和大腦皮質的各種類型的細胞中。研究發現，EPO-EPOR結合而介導的細胞信號通路對由腦缺血引起的神經細胞損傷具有保護作用。其機制除EPO能促進紅細胞生成以提高血液攜氧量外，還與其拮抗興奮性氨基酸毒性、清除自由基、抗炎癥、抗凋亡、提高神經突觸傳遞以及類似神經營養因子樣作用直接發揮神經營養、神經保護作用有關。有實驗［11］證實，HIF-1α可以增加EPO的表達，在缺氧情況下，EPO可使谷氨酸的產生減少且增加神經元的數目。Digicaylioglu等［12］研究發現，EPO和胰島素樣生長因子-1聯合使用可以減少N-甲基-D-天冬氨酸介導的細胞凋亡。本實驗結果顯示缺血再灌注6h后大腦皮質的各型細胞中EPO的表達增加，48h達高峰，7d仍有陽性表達，且TSG干預組的EPO的表達較模型組的表達明顯增加。

二苯乙烯苷是中藥何首烏的活性成分，它可通過清除體內過多的氧自由基、減少神經細胞凋亡、降低細胞內鈣離子濃度、抑制興奮性氨基酸活性而起到神經保護作用。本實驗結果發現TSG干預組各時間點HIF-1α及EPO蛋白表達均較模型組增加，TSG干預組在腦缺血再灌注后的24h、48h及7d時間點神經功能評分均較模型組低。綜上所述，TSG可能通過誘導內源性HIF-1α及EPO的表達增加，對缺血再灌注損傷后老齡大鼠的神經元具有保護作用，這為二苯乙烯苷在臨床上的應用提供了實驗基礎。

圖1 對照組24h(HIF-1α，×400)

圖2 模型組24h(HIF-1α，×400)

圖3 TSG干預預24h(HIF-1α，×400)

圖4 對照組48h(EPO，×400)

圖5 模型組48h(EPO，×400)

圖6 TSG干預組48h(EPO，×400)

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