PDTC對慢性致癇大鼠海馬NF-κB及IL-10表達的影響

劉國軍， 黃建敏， 李雪斌， 蒙蘭青， 黃瑞雅

炎癥因子與抗炎因子的失衡在癲癇的發生和發展過程中起重要的作用［1］。核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa，NF-κB)與多種基因的啟動子和增強子的κB序列特異結合，參與炎癥反應有關基因的轉錄和調控，與一系列細胞因子、炎癥介質的產生和釋放有關［2］。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrro1idine dithiocarbamate，PDTC)是一種低分子硫醇抗氧化劑，能特異性阻斷NF-κB的傳導通路［3］。但到目前為止，PDTC能否參與調節癲癇發作誘發的抗炎癥反應尚未見報道。本實驗將檢測癲癇大鼠海馬中 NF-κΒ/p65與白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的水平，了解 NF-κΒ/p65和 IL-10在癲癇發病過程中變化的意義，探討其在發病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性 SD大鼠90只，體重(220±20)g，鼠齡3個月，購自廣西醫科大學實驗動物中心。所有動物按照自然晝夜、自由進食進水、20℃ ～25℃環境溫度、標準大鼠飼料常規飼養。

1.1.2 主要試劑 戊四氮(PTZ)、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)購自美國Sigma公司，引物由上海生工公司合成，熒光定量PCR相關試劑盒購自大連寶生物公司，IL-10 ELISA試劑盒購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 制備動物模型 將90只SD大鼠隨機分為3組。PTZ模型組(n=33):腹腔注射亞驚厥量(35mg/kg)的PTZ(濃度為1%);PDTC干預組(n=33):在PTZ注射前60min，按100mg/kg行腹腔注射PDTC(濃度為1%);生理鹽水(NS)對照組(n=24):以等量生理鹽水代替PTZ腹腔注射。所有大鼠每日給藥一次，共持續35d。給藥后觀察40～50min大鼠行為變化，并記錄大鼠的癲癇發作情況，參照Racine的6級標準評分［4］:0級:無任何反應;I級:面部陣攣，包括眨眼、動須、節奏性咀嚼等;Ⅱ級:I級加節律性點頭;Ⅲ級:Ⅱ級加前肢肌陣攣，但無后肢直立位;IV級:Ⅲ級加后肢直立位;V級:全面性強直-陣攣發作，并失去體位控制，或抽搐死亡。各組大鼠分別于用藥后14d、21d、28d和35d 4個時間點麻醉取材，每個時間點隨機取6只。在乙醚麻醉、無菌無熱源條件下，斷頭取腦，冰上快速分離海馬，緩沖液洗滌，于－80℃低溫保存。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測NF-κΒ/p65和IL-10的mRNA表達 用Trizol提取大鼠海馬組織的總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA，再以SYBR GreenⅠ作為熒光標記物，在實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增反應。以β肌動蛋白(β-actin)mRNA為內參照。NF-κΒ/p65:上游引物5’-GTCACCAAAGACCCACCTCACC-3’，下游引物5’-CGGACCGCATTCAAGTCATAGTC-3’，擴增片段245bp;IL-10:上游引物5’-GTCCTTTCACTTGCCCTCATC-3’，下 游 引 物 5’-CAAACTGGTCACAGCTTTCGA-3’，擴增片段179bp;β-actin:上游引物 5’-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，下游引物5’-CGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3’，擴增片段230bp。擴增條件:95℃變性5s，60℃退火及延伸34s，共反應40個循環，最后做溶解曲線分析。用2-ΔΔct法進行相對定量分析。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-10蛋白的表達 海馬組織稱重，制備10%的海馬組織勻漿液，離心后取上清液，嚴格按照說明書步驟檢測IL-10蛋白的表達。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，實驗所得的數據以均數±標準差(±s)表示，各組均數之間兩兩比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性致癇大鼠行為學觀察 對照組大鼠腹腔注射生理鹽水后無異常行為改變。PTZ模型組于14d時開始出現發作反應，隨著給藥時間的延長發作等級漸重，但是到28d后發作等級有所減輕。PDTC干預組發作時間比PTZ組晚4～5d，相同時間點發作等級也較輕些。

2.2 海馬組織中NF-κB/P65 mRNA的表達各個時間點，對照組海馬組織中都可見一定量的NF-κB/p65 mRNA表達。實驗14d時，PTZ模型組NF-κB/p65 mRNA表達增多，與對照組和干預組相比較均有顯著差異(P＜0.01);21d時，模型組NF-κB/p65 mRNA表達進一步增多，28d達高峰，均明顯高于對照組和干預組(P ＜0.01);35d時，模型組 NF-κB/p6 5mRNA表達有所下降，但是也高于對照組和干預組(P＜0.01)。14d時干預組與對照組比較無明顯變化(P ＞0.05)，21d、28d 和35d 時，干預組與對照組比較均有顯著差異(P＜0.01)(見表1)。

2.3 海馬組織中IL-10 mRNA的表達 各個時間點，對照組海馬組織中都可見一定量的IL-10 mRNA表達。實驗14d時，PTZ模型組IL-10 mRNA表達增多，與對照組和干預組相比較均有顯著差異(P＜0.01);21d時，模型組IL-10 mRNA表達進一步增多，28d達高峰，均明顯高于對照組和干預組(P＜0.01);35d時，模型組 IL-10 mRNA表達有所下降，但是也高于對照組和干預組(P＜0.01)。14d時干預組與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，21d、35d和28d時干預組與對照組比較均有顯著差異(P ＜0.01或 P ＜0.05)(見表2)。

2.4 海馬組織中IL-10蛋白的表達 對照組海馬組織中也有IL-10蛋白的表達。模型組海馬組織中IL-10蛋白表達隨著用藥時間的延長逐漸增高，28d達高峰，在相同時間點，與對照組和干預組比較差異均有顯著性意義(P＜0.01)。干預組在用藥21d和28d與對照組比較差異均有顯著性意義(P＜0.05);干預組在用藥14d和35d與對照組比較差異均無顯著性意義(P＞0.05)(見表3)。

表1 不同時間點大鼠海馬組織NF-κB/p65 mRNA表達的比較±s)

表1 不同時間點大鼠海馬組織NF-κB/p65 mRNA表達的比較±s)

與對照組相比*P＜0.01;與對照組相比#P＞0.05;與PDTC組相比ΔP＜0.01

組別時間(d)14d 21d 28d 35d NS對照組PTZ模型組PDTC干預組0.74 ±0.071.37 ±0.13＊△0.85 ±0.15#0.77 ±0.111.78 ±0.14＊△1.22 ±0.20*0.82 ±0.101.97 ±0.23＊△1.34 ±0.14*0.83 ±0.171.43 ±0.16＊△1.02 ±0.12*

表2 不同時間點大鼠海馬組織IL-10 mRNA表達的比較±s)

表2 不同時間點大鼠海馬組織IL-10 mRNA表達的比較±s)

與對照組相比*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05;與對照組相比#P ＞0.05;與 PDTC 組相比 ΔP＜0.01

組別時間(d)14d 21d 28d 35d NS對照組PTZ模型組PDTC干預組0.47 ±0.110.71 ±0.10＊△0.54 ±0.10#0.52 ±0.141.15 ±0.18＊△0.62 ±0.12＊＊0.53 ±0.061.38 ±0.20＊△0.74 ±0.11*0.56 ±0.121.11 ±0.16＊△0.67 ±0.12＊＊

表3 不同時間點大鼠海馬組織IL-10蛋白表達的比較±s)(pg/ml)

表3 不同時間點大鼠海馬組織IL-10蛋白表達的比較±s)(pg/ml)

與對照組相比*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05;與對照組相比#P ＞0.05;與 PDTC 組相比 ΔP＜0.01

組別時間(d)14d 21d 28d 35d NS對照組PTZ模型組PDTC干預組159.48 ±5.3229.15 ±6.0＊△171.01 ±4.2#155.28 ±4.6283.01 ±5.0＊△178.62 ±5.2＊＊161.85 ±3.8371.30 ±6.4＊△191.56 ±4.1＊＊158.54 ±4.1267.43 ±5.9＊△172.16 ±3.9#

3 討論

NF-κB是一類蛋白因子，能夠與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κB序列特異結合，從而啟動及促進相應基因轉錄的蛋白因子，稱為核轉錄因子κB。膠質細胞中NF-κB主要是促進炎性細胞因子和免疫表面分子表達，促進免疫反應［5］。目前關于NF-κB活化在癲癇發病中的作用有著不同的觀點。一方面，認為NF-κB參與了急性炎癥過程，抑制NF-κB過度活化，可降低炎癥因子的過度表達，發揮抗癲癇的作用［6，7］，過度激活會加重癲癇的發病。Wang等人［8］在實驗中也發現癲癇患兒外周血單個核細胞中NF-κB的活化均明顯增高，并且與癲癇發作的嚴重程度呈正相關。我們在先前的實驗中發現應用PTZ誘導大鼠慢性癲癇發作后，大鼠海馬組織細胞核內NF-κB/p65蛋白產物表達增多，炎癥因子表達也增加，說明癲癇發作可能引起核轉錄因子NF-κB的活化及炎癥因子的產生。另一方面，Lubin等［9］在紅藻氨酸急性致癇大鼠實驗中顯示，NF-κB表達增高，與DNA結合活性增強，腦源性神經營養因子(BDNF)表達增多，應用NF-κB信號通路抑制劑后，BDNF表達受到抑制，癲癇潛伏期縮短，對癲癇的易感性增強，進而加重癲癇的發病，說明NF-κB信號通路的激活也有可能在急性癲癇發病中起到了保護的作用。在本研究結果顯示，在慢性致癇過程中，癲癇發作程度嚴重時期出現在21d～28d，而NF-κB/P65 mRNA的表達量于28d達高峰，與Zhao等人［10］的研究結果一致。同時應用PDTC抑制NF-κB信號通路后NF-κB/P65 mRNA的表達量下降，癲癇發作程度減輕。35d時癲癇癥狀減輕，NF-κB/p65 mRNA的表達也下降，推測大鼠經亞驚厥劑量的致癇劑反復作用后，谷氨酸等興奮性氨基酸對此產生適應，大鼠對致癇劑可能產生了耐藥。所以我們推測NF-κB在癲癇發病中的作用取決于其所調節下游因子中對癲癇發病有利與不利者所占的比例，如果有利因子如BDNF表達多于不利因子如炎癥因子，則表現出保護作用;反之，如果炎癥因子等不利因子產生過度就會加重癲癇發病。

IL-10是一種與中樞神經系統損傷相關的重要抗炎因子，可由神經元和神經膠質細胞產生，通過與細胞膜上的IL-10R結合，激活JAK家族的酪氨酸激酶JAK1、JAK2，引起酪氨酸磷酸化，進而刺激信號轉導活化轉錄因子T3(STAT3)，產生相應的生物效應，即通過直接或間接調節神經元興奮性、神經遞質的釋放等途徑參與癲癇的發病過程［11］。NF-κB信號途徑又是介導IL-10免疫抑制和抗炎作用的必要通路。國內外諸多實驗表明癲癇患者和癲癇動物模型外周血和腦內IL-10的含量明顯增高，可能通過增加GABA的抑制作用、抑制 NO自由基的作用、抑制NF-κB的活化、抑制大腦皮層神經元興奮性氨基酸NMDA受體的表達和抑制鈣離子內流等發揮部分抗癲癇作用［12］。本研究顯示，模型組中，隨著用藥時間的延長，大鼠癲癇發作的程度逐漸加重，嚴重時期出現在21d～28d，而IL-10 mRNA的表達量于28d達高峰，說明癲癇的嚴重程度與IL-10 mRNA的表達量相關。推測通過動物增強IL-10的表達來發揮抗炎作用，起到保護作用，并且隨著炎癥的加重而升高，隨著炎癥的減輕而下降。應用PDTC抑制NF-κB信號通路的激活，使NF-κB/p65的活化程度下降，其下游所調控的炎癥基因轉錄下降，使相應炎癥因子合成減少，IL-10表達量也下降。

綜上所述，PDTC能對慢性癲癇大鼠腦部炎癥反應起到保護作用，其機制與通過抑制NF-κB的活化，來下調IL-10的表達，減少炎癥反應的發生，進而減輕癲癇的發作有關。

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