CB1受體激動劑WIN55212-2改善帕金森病運動并發癥的實驗研究

馬雅萍， 宋 璐， 劉振國， 巴茂文， 卞雷斯

長期使用左旋多巴類藥物治療帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)常引發運動并發癥，如癥狀波動、異動癥(levodopa induced dyskinesia，LID)和開關現象等。除疾病嚴重程度和發病年齡外，PD運動并發癥的發生還與左旋多巴藥物日服劑量、日服次數密切相關［1］。PD運動并發癥的發病機制尚不明確，現有的研究指出可能和PD患者長期服用半衰期較短的外源性多巴藥物，造成對紋狀體棘狀神經元上多巴胺受體異常的波動性刺激，引發了皮質紋狀體通路及紋狀體內部的一系列可塑性改變有關。因此開發能夠調節紋狀體內突觸可塑性改變以及神經遞質傳遞紊亂的治療策略，是當前PD研究的一個熱點問題。

在中樞神經系統，大麻素類物質發揮作用主要依賴于大麻素CB1受體。大麻素CB1受體多分布于基底節、小腦等運動調節區域，表達于谷氨酸以及GABA能神經元突觸前膜，對神經遞質的釋放具有重要的調控作用［2］。多項研究提示，大麻素CB1受體激動劑用藥可緩解 LID行為［3～5］。但 CB1受體激動劑防治PD運動并發癥的機制尚不清楚。為此，我們利用6-OHDA制備的單側PD大鼠模型，觀察了CB1受體激動劑WIN55212-2與左旋多巴聯合應用對大鼠行為學以及紋狀體重要的信號傳導蛋白多巴胺和環磷腺苷調節的磷酸化蛋白-32(dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32，000，DARPP-32)Thr75位點以及胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)Thr202/Tyr204位點磷酸化所產生的影響，以期探討CB1受體激動劑對LID的治療效果及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性Spraque-Dawley大鼠，體重180～220g，清潔級，由新華醫院動物實驗中心提供［合格證號:SYXK(滬)2003-0031］。6-OHDA、阿樸嗎啡、左旋多巴、芐絲肼、維生素 C(Sigma公司);WIN55212-2(Cayman Chemical公司);大鼠腦立體定向儀(日本Narishige公司);兔源性多克隆DARPP-32抗體、抗磷酸化DARPP-32(Thr75)抗體、抗ERK抗體、小鼠源性多克隆抗磷酸化ERK(Thr202/Tyr204)抗體(Cell Signaling Technology公司);小鼠源性抗βactin抗體、tublin抗體、HRP標記的山羊抗兔二抗、HRP標記的山羊抗小鼠二抗、蛋白裂解液、凝膠配置試劑盒(碧云天公司);DAB試劑盒(Vector公司);ECL化學發光試劑盒(Millipore公司);Western Blot電泳及轉膜裝置(BIO-RAD公司)。

1.2 偏側PD大鼠模型的制備與評定 50只SD大鼠經反復行為檢測確認無旋轉行為后進行實驗。大鼠經氯胺酮麻醉后，嚴格平顱位固定于大鼠腦立體定向儀上，參照包新民、舒斯云所著大鼠腦立體定向圖譜，確定右側前腦內側束(MFB)坐標:(1)前囟后3.7mm，矢狀縫右側1.7mm，顱骨骨膜下7.8mm，門齒線2.4mm;(2)前囟后 4.4mm，矢狀縫右側1.2 mm，顱骨骨膜下7.8mm，門齒線2.4mm。電鉆鉆孔，用10μl的微量注射器抽取8μl 6-OHDA(0.2%維生素 C 配置，濃度 4μg/μl)，每點注射 4μl，留針 10min后緩慢退針縫合創口;部分大鼠注入溶劑作為假手術對照。3w后，大鼠腹腔注射阿樸嗎啡(0.5mg/kg)，平均旋轉頻率﹥7次/min為成功PD模型。

1.3 動物分組及用藥 模型成功的PD大鼠隨機分為PD組、用藥1組和用藥2組，每組各6只，分別接受每日2次(9am和5pm)的溶劑、左旋多巴/芐絲肼+溶劑(左旋多巴50mg/kg，芐絲肼12.5mg/kg，溶于含0.2%維生素C的消毒生理鹽水中)和左旋多巴/芐絲肼+WIN55212-2(1mg/kg)腹腔注射，持續21d，以評估CB1受體激動劑WIN55212-2和左旋多巴聯合用藥對PD大鼠運動并發癥的預防作用。

1.4 行為學觀察 在治療過程中，于第1、7、14和21天上午用藥后進行行為學觀察。(1)對側旋轉計數:大鼠在用藥后每10min評估一次，每次觀察5min，記錄其5min內的旋轉圈數，將旋轉圈數增至平均旋轉圈數20%的第1個5min和降至該值的第1個5min之間的時間作為藥效期;劑峰5min的旋轉次數定為劑峰旋轉次數(即注射左旋多巴后，每5min記錄旋轉次數，旋轉次數最多的時間為劑峰旋轉時間，此時的旋轉次數為劑峰旋轉次數)。計算藥效期的長短和劑峰旋轉圈數。(2)無反應率觀察:大鼠每次用藥后觀察其運動活動，記錄整個用藥期間無反應的次數。

1.5 Western blot蛋白免疫印跡 大鼠在最后1d左旋多巴注射后30min，乙醚麻醉，斷頭處死，快速開顱取腦分離雙側紋狀體，加入適量組織裂解液和PMSF，超聲裂解，提取總蛋白，測蛋白濃度后加入5xSDS上樣緩沖液，入沸水煮5min，冰上冷卻。100μg蛋白樣本經10%SDS-PAGE電泳分離后，經電轉膜儀(Bio-Rad)轉移蛋白至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的1xTBST室溫封閉1h，按相應濃度稀釋第一抗體抗磷酸化DARPP-32(Thr75)(1∶800)或抗磷酸化ERK(Thr202/Tyr204)(1∶500)或抗βactin或抗tubulin(1∶1000)，4℃輕搖孵育膜過夜。次日TBST洗膜5min×3次，加HRP標記的山羊抗兔或者山羊抗小鼠二抗(均為1∶800)，室溫下輕搖孵育3h，TBST洗膜5min×3次。在暗室中配置ECL顯色混合液(A液∶B液 =1∶1)，滴加于PVDF膜上，膠片曝光后顯影、定影、掃描保存。

1.6 定量分析及統計 采用Smart View 2000圖像分析軟件計算各樣本目的蛋白條帶灰度強度與面積值的乘積。實驗數據均以均數±標準差±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)統計，顯著水平為P＜0.05，由SPSS11.5軟件包完成。

2 結果

2.1 行為學結果分析

2.1.1 WIN55212-2長期注射對PD大鼠行為學的影響 左旋多巴+溶劑長期注射使PD大鼠的劑峰旋轉次數在21d的處理過程中呈增加的趨勢，到第7天后開始維持一個較高的水平，在第7、14、21天的劑峰 5min旋轉次數分別為(159.33 ±45.37)、(153.33 ±60.14)、(154.67 ± 52.39)次，比第 1 天(59.67±16.50)次均明顯升高，差異有統計學意義(P﹤0.05);而第7、14、21天之間的劑峰旋轉次數差異則沒有統計學意義(P＞0.05)。WIN55212-2+左旋多巴長期聯合注射則使PD大鼠的劑峰旋轉次數的增加受到一定的抑制，第1、7、14、21天的劑峰5min旋轉次數分別為(86.00 ±42.58)、(103.00 ±24.33)、(132.33 ±20.13)、(131.00 ±44.31)次，雖然劑峰旋轉次數逐漸升高，但沒有統計學差異(P＞0.05)。第21天時用藥組大鼠的劑峰旋轉次數比用藥1組少，但是差異無統計學意義(P＞0.05)(見圖1)。

左旋多巴+溶劑長期注射使PD大鼠的旋轉持續時間在21d的處理過程中呈逐漸縮短的趨勢，第7、14、21天的旋轉反應時間分別為(143.33±7.64)、(126.67 ±5.77)、(106.67 ±7.64)min，均比第1 天(193.33 ±5.77)min明顯減少，并且第14、21天旋轉持續時間也比第7天明顯減少，差異均有統計學意義(P﹤0.05)。而模型組大鼠第7天旋轉持續時間(158.33±20.21)min比第1 天(186.67±5.77)min減少，差異有統計學意義(P﹤0.05);但其后2w的旋轉持續時間則維持在一個較穩定的水平，第14、21天旋轉持續時間分別為(153.33±5.77)、(156.67 ±5.77)min，和第 7 天相比沒有統計學差異(P＞0.05)。并且在第14、21天時，用藥2組大鼠的旋轉持續時間比用藥1組長，差異具有統計學意義(P﹤0.05)(見圖2)。

2.1.2 WIN55212-2長期注射對PD大鼠無反應率的影響 左旋多巴+溶劑長期處理期間，幾乎所有的PD大鼠均出現過注射后無反應的現象，此時PD大鼠全身僵硬，呈凍結狀，且幾乎不受其他大鼠旋轉的影響，稱為“關”期動物。并且模型組無反應率也隨左旋多巴治療時間的延長而增高，第1周無反應率為3.6%，第2、3周顯著升高，分別是23.8%和28.6%，這種無反應的現象幾乎在所有PD大鼠上發生過。而用藥組在整個治療過程中，無反應率幾乎等于0，僅有一只大鼠出現一次無反應現象。

2.2 WIN55212-2用藥對紋狀體區DARPP-32(Thr34)磷酸化的影響 Western blot顯示，長期左旋多巴治療，DARPP-32(Thr75)磷酸化顯著降低至(48.97% ±1.57%)，與 PD 組相比，具有統計學差異(P＜0.01);長期聯合左旋多巴/大麻素CB1受體激動劑WIN55212-2用藥后，損傷側紋狀體DARPP-32(Thr75)磷酸化減少更為顯著至(35.23% ±3.67%)，與PD組以及用藥1組比較，均具有統計學差異(P ＜0.01)(見圖3)。

2.3 WIN55212-2用藥對紋狀體區 ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化的影響 經過長期左旋多巴治療，紋狀體區ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化顯著升高至(124.81% ±3.74%)，與PD組相比，差異具有統計學差異(P＜0.01);長期聯合左旋多巴、大麻素CB1受體激動劑WIN55212-2用藥后，損傷側紋狀體ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化增加至(117.07% ±1.46%)，較PD組增加，而較用藥1組減少，兩兩之間的差異具有統計學差異(均P＜0.01)(見圖4)。

圖1 WIN55212－2長期用藥對PD大鼠劑峰轉速的影響

圖2 長期WIN55212－2對PD大鼠旋轉反應時間的影響

圖3 Western blot顯示紋狀體部位DARPP－32Thr75的改變U:未損側;L:損傷側

圖4 Western Blot顯示紋狀體部位磷酸化ERKThr202/Tyr204)的改變，U:未損側;L:損傷側

3 討論

臨床資料顯示，PD患者在長期左旋多巴治療后出現異動癥等運動并發癥，隨著疾病的加重和治療時間的延長，運動并發癥的發生頻率增加、程度加重。本研究發現PD大鼠接受長期左旋多巴用藥后，出現了旋轉反應時間的縮短(類似PD患者的癥狀波動)、劑峰旋轉次數增加(類似PD患者的異動癥)及不可預料的關期(類似PD患者的開關現象)［6，7］。這種大鼠模型與人類左旋多巴誘發的運動并發癥有表現特性上的相似性，表明二者可能具有相同的病理機制，可以作為良好的研究模型。

我們發現長期聯合應用CB1受體激動劑WIN55212-2和左旋多巴，減輕了單獨使用左旋多巴所導致的PD大鼠旋轉反應時間的縮短和劑峰旋轉圈數的增加，并使關期發生頻率明顯減少，說明CB1受體激動劑與左旋多巴合用可預防PD運動并發癥的出現。我們進一步研究發現CB1受體激動劑WIN55212-2與左旋多巴聯合用藥，可降低運動并發癥大鼠模型損傷側紋狀體DARPP-32(Thr75)和ERK1/2(Thr202/Tyr204)的磷酸化表達。

近年研究表明PD運動并發癥的發生與表達D1受體的直接通路及其下游PKA、ERK等信號轉導通路的激活關系密切［8，9］。DARPP-32特異性表達于紋狀體投射神經元，PKA通路激活能夠使DARPP-32(Thr34)磷酸化，將之轉化為蛋白磷酸酶1(protein phosphatase-1，PP1)的抑制劑，發揮抑制下游目的蛋白去磷酸化的作用;同時還能夠激活蛋白磷酸酶-2A(protein phosphatase-2A，PP-2A)導致 Thr75去磷酸化，解除Thr75磷酸化后對PKA通路的抑制作用，從而放大PKA通路的效應［10，11］。因此磷酸化位點的不同可予DARPP-32以相反的生理效應:Thr75位點磷酸化后可抑制PKA的活性;而DARPP-32的Thr34位點磷酸化后，可抑制下游蛋白去磷酸化，增強PKA通路活性，從而調控下游蛋白神經遞質受體和離子通道等的磷酸化狀態。但是，紋狀體間接通路MSNs和直接通路MSNs內PKA通路的激活對運動行為有相反的作用:前者可抑制運動行為，而后者則增強運動能力。

Andersson等［12］研究發現，大麻素CB1受體激動劑在引起小鼠運動抑制的同時，還可上調紋狀體區DARPP-32Thr34位點的磷酸化表達;但對于DARPP-32、D2受體或腺苷A2a受體基因敲除的小鼠，大麻素CB1受體激動劑的抑制運動及上調DARPP-32(Thr34)磷酸化的作用均顯著減弱，而D2受體或腺苷A2a受體共表達于間接通路MSNs，這提示大麻素CB1受體激動劑抑制運動能力的作用是由激活PKA通路介導的，且這一調控作用位點主要位于表達D2受體和腺苷A2a的間接通路MSNs，這也與"間接通路MSNs內PKA通路的激活可抑制運動行為"的這一研究結論相符。因此，CB1受體激動劑與左旋多巴協同用藥可能通過下調DARPP-32(Thr75)磷酸化，從而上調間接通路投射神經元內PKA通路的活性，產生了抑制運動并發癥的作用。

用藥2組大鼠紋狀體區ERK1/2(Thr202/Tyr204)磷酸化表達雖然較用藥1組有下降，但下降幅度較小;且較PD組仍然增高。Valjent等［13］發現DARPP-32(Thr34)磷酸化能夠通過激活ERK1/2上游的激酶MEK以及抑制ERK去磷酸化，增加ERK1/2的活性。該現象也出現在如可卡因以及安非他明等多巴胺能藥物誘導精神運動敏化的過程中。因此，用藥2組ERK1/2磷酸化的高表達可能與CB1受體激動劑對間接通路MSNs內的DARPP-32活性的調節作用有關。

綜上所述，本實驗發現長期聯合使用CB1受體激動劑WIN55212-2和左旋多巴能夠抑制PD大鼠運動并發癥的發生，該作用可能通過調節間接通路MSNs內DARPP-32和ERK磷酸化，從而增強間接通路的功能，產生行為抑制和緩解PD運動并發癥的作用。

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