棓丙酯對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

呂首旭， 賈洪麗， 陳春光， 孫麗紅， 徐長(zhǎng)慶

棓丙酯(propylgallate，PrG)是由中藥赤芍中的活性成分沒食子酸經(jīng)酯化反應(yīng)合成的沒食子酸的酯化衍生物，具有抗血小板聚集、抗炎、抗自由基、擴(kuò)張血管、松弛血管平滑肌、增加血流量和供氧量、改善微循環(huán)等作用［1，2］。有文獻(xiàn)報(bào)道，其對(duì)缺血性組織損傷有一定的保護(hù)作用，臨床上主要用于預(yù)防和治療心腦血管疾病［3～5］。本研究采用線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞致腦缺血-再灌注模型，探討棓丙酯的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 棓丙酯注射液(propylgallate injection，棗莊百科藥業(yè)有限公司);BCA蛋白測(cè)定試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司);SOD測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);MDA測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);TTC(天津百世化工有限公司，進(jìn)口分裝);多聚甲醛(天津科密歐化工有限公司);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。US-640型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman公司);高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);－86℃超低溫冰箱(SANYO公司)。

1.2 動(dòng)物與分組 清潔級(jí)健康成年SD大鼠，雌雄兼用，體重230～320g，由吉林大學(xué)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組(sham組);模型組(I/R組);棓丙酯組(Propylgallate Injection，PrG組)。

1.3 模型的制備 實(shí)驗(yàn)大鼠參照Zea Longa的方法［6］，線栓法制備大腦中動(dòng)脈局灶性缺血-再灌注模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。動(dòng)物術(shù)前12h禁食，自由飲水。10%水合氯醛(3.5 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸部正中切口，鈍性分離組織，暴露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈上距分叉約5mm處剪口，將魚線經(jīng)頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈。模型組插入深度約18mm，直至感到輕微阻力停止，假手術(shù)組插入深度約8mm。缺血2h后將魚線圓頭移出頸內(nèi)動(dòng)脈完成再灌注。棓丙酯保護(hù)組在模型缺血5min內(nèi)經(jīng)尾靜脈按35mg/kg注射。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 按照Zea Longa的方法［6］，模型缺血2h，評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)行為缺損程度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分，無任何神經(jīng)功能缺失體征;1分，未損傷側(cè)前肢不能伸展;2分，向未損傷側(cè)弧線行走或追尾轉(zhuǎn)圈;3分，向未損傷側(cè)傾斜或傾倒;4分，意識(shí)障礙，無自主行走。其中無意識(shí)、不能行走的大鼠剔除。

1.5 腦梗死面積 實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭取腦，置于－20℃冰箱20min，將腦組織冠狀均勻切分成5片，置于2%TTC磷酸緩沖溶液(pH=7.4)中，37℃水浴避光20min，約5min翻動(dòng)一次，顯色后置于4%多聚甲醛溶液中固定12h，用數(shù)碼相機(jī)拍照。正常組織顯示為紅色，白色區(qū)是缺血梗死區(qū)。

1.6 組織SOD活性和MDA含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭取腦，冰盒上分離大腦右側(cè)中段皮質(zhì)，稱重，用生理鹽水制備1%和10%的組織勻漿，4000r/min離心，取上清液，嚴(yán)格按照BCA、SOD和MDA試劑盒說明檢測(cè)蛋白含量、SOD活性和MDA含量。

1.7 觀察腦皮質(zhì)區(qū)形態(tài)學(xué)變化 各組大鼠麻醉，開胸暴露心臟，輸液裝置由左心室進(jìn)入主動(dòng)脈，先輸注生理鹽水約150ml，再輸注4%多聚甲醛磷酸緩沖液約250ml(pH=7.4，速度約40滴/min)。灌注結(jié)束后，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定48h，常規(guī)制備腦組織石蠟切片進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化，并拍照分析。

1.8 觀察超微結(jié)構(gòu)變化 實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉，斷頭取腦，在冰盒上迅速分離大腦右側(cè)中段下方皮質(zhì)約0.2mm薄片3～4片，置于戊二醛中，12h后送檢。常規(guī)制作電鏡標(biāo)本。在電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，單因素方差分析數(shù)據(jù)，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死損傷程度、SOD活性和MDA含量變化 假手術(shù)組:大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均為0分，腦組織無梗死灶;模型組:與假手術(shù)組比較，神經(jīng)行為缺損嚴(yán)重，腦梗死面積約40%，腦組織的SOD活性降低，MDA含量升高;棓丙酯組:與模型組比較，神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積和MDA含量降低，SOD活性升高(見表1、見圖1)。

2.2 皮質(zhì)區(qū)形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組:神經(jīng)元數(shù)量豐富，結(jié)構(gòu)完整，核膜清晰，核仁大，突起明顯;模型組:神經(jīng)元大量片狀壞死伴嚴(yán)重水腫;棓丙酯組:水腫程度減輕，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和數(shù)量有所恢復(fù)(見圖2)。

2.3 超微結(jié)構(gòu)變化 假手術(shù)組:核膜結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)分布均勻，突觸、突觸小泡和細(xì)胞器(如:尼氏體和線粒體)數(shù)量豐富，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整;模型組:核膜結(jié)構(gòu)崩解，核內(nèi)染色質(zhì)邊集，核周嚴(yán)重水腫;細(xì)胞器數(shù)量減少，線粒體嵴消失，水腫、空泡變，尼氏體數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，脫顆粒;棓丙酯組:神經(jīng)元和細(xì)胞器損傷減輕。

表1 棓丙酯對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和SOD、MDA含量的影響±s)

表1 棓丙酯對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和SOD、MDA含量的影響±s)

與假手術(shù)組比較△P＜0.01;與假手術(shù)組比較*P＜0.05;與模型組比較#P ＜0.01

假手術(shù)組模型組棓丙酯組02.80 ±0.421.60 ±0.52#65.99 ±3.0047.57 ±3.41△56.49 ±3.21△#1.92 ±0.174.39 ±0.38△2.46 ±0.19*#

圖1 棓丙酯對(duì)缺血-再灌注損傷引起的腦梗死影響

3 討論

近年來，缺血性腦損傷的發(fā)病率逐年上升，其病因及機(jī)制復(fù)雜。缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，這種恢復(fù)血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury)。目前認(rèn)為，自由基連鎖反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一［7～9］。抑制再灌注損傷成為目前治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。棓丙酯，即沒食子酸丙酯(propyl gallate，PrG)，又名赤芍801，化學(xué)名稱為:3，4，5-三羥基苯甲酸丙酯，是從赤芍中分離得到的活性成份，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而得到的更強(qiáng)生物效應(yīng)化合物。通過對(duì)其活性成分沒食子酸及其酯類構(gòu)效關(guān)系的深入研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸的酯化衍生物具有抗氧化、清除自由基、抗血小板聚集、減輕缺血再灌注損傷等作用。本文采用線栓法復(fù)制大鼠MCAO所致缺血再灌注模型，檢測(cè)神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死面積、光鏡和電鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，觀察棓丙酯注射液的保護(hù)效應(yīng)，測(cè)定缺血區(qū)組織中超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量的變化以探討其可能的作用機(jī)制。

通過神經(jīng)細(xì)胞的尼氏小體染色，對(duì)缺血再灌注后皮質(zhì)區(qū)病理改變以及PrG治療后的病理變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注2h后有明顯的細(xì)胞變性壞死。說明缺血再灌注對(duì)皮質(zhì)區(qū)的損害非常嚴(yán)重，與其他學(xué)者的研究相似。對(duì)缺血再灌注2h后的超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞器包括線粒體損傷嚴(yán)重，染色質(zhì)大量邊集，膜系統(tǒng)大量崩解。而應(yīng)用PrG治療后，通過尼氏小體染色亦顯示損傷較缺血再灌注組明顯減輕;超微結(jié)構(gòu)則顯示了PrG對(duì)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有良好的保護(hù)作用，尤其是對(duì)膜系統(tǒng)的保護(hù)最為有效。以上均提示應(yīng)用PrG組于缺血再灌注2h后皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的病理?yè)p傷性改變較缺血再灌注組減輕，說明PrG對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定代謝物MDA的含量可反映組織自由基的含量和脂質(zhì)過氧化程度。SOD是一種帶陰性電荷的金屬蛋白酶，是細(xì)胞內(nèi)主要的對(duì)抗氧自由基的酶促抗氧化防御系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PrG組于缺血再灌注2h后腦組織勻漿中SOD水平較缺血再灌注組明顯增高，而MDA水平較缺血再灌注組明顯降低，PrG組及模型組與假手術(shù)組相比較，SOD均低于假手術(shù)組，而MDA均高于假手術(shù)組，這表明PrG能夠提高缺血再灌注后腦組織內(nèi)SOD的含量，從而抑制質(zhì)脂過氧化反應(yīng)，減少M(fèi)DA的生成。因此PrG具有一定的抗自由基作用，其對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與抑制自由基產(chǎn)生、減少抗氧化劑的消耗有關(guān)。

本研究顯示:模型組神經(jīng)行為缺損嚴(yán)重(2.80±0.42)，腦梗死面積約40%，光鏡和電鏡下神經(jīng)元、細(xì)胞器及神經(jīng)氈區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重。與模型組比較，PrG組的神經(jīng)功能評(píng)分降低(1.60±0.52)，腦梗死面積明顯減小，神經(jīng)元及細(xì)胞器的數(shù)量和結(jié)構(gòu)都有明顯恢復(fù)，表明棓丙酯對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

綜上，本文證明棓丙酯對(duì)腦缺血-再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并通過此途徑對(duì)缺血再灌注腦組織的損傷發(fā)揮保護(hù)作用有關(guān)。棓丙酯的腦保護(hù)的具體機(jī)制有待于今后進(jìn)一步研究。

圖2 大腦皮層HE染色觀察的形態(tài)學(xué)變化(1∶200;2∶600)

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