轉化生長因子β-1對神經元樹突生長以及突觸素1表達的影響

桂 韋， 余傳勇， 汪 凱， 王 玉

轉化生長因子-β1(TGF-β1)是一種多功能的細胞因子，其作用主要參與細胞生長、分化、炎癥以及組織修復等功能。在中樞神經系統中，神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞都可以表達TGF-β1，在正常腦神經細胞TGF-β1表達很少，而在遭受腦損傷如創傷性腦病、癲癇、腦血管疾病等刺激時表達明顯增加［1］。眾多研究表明，TGF-β1 能減少局灶性腦梗死面積，促進神經功能恢復，而其他細胞因子(如神經營養因子及堿性成纖維生長因子)這種作用強度遠不及 TGF-β1［2］，表明 TGF-β1 具有強大的潛在應用價值。但目前國內外關于TGF-β1這種促進神經功能恢復的機制仍不甚明確。眾所周知，雖然星形膠質細胞數量上是神經元的9倍，但是神經元才是接受刺激、進行信息傳遞和處理的主要功能單位。突觸活動不但決定了特定神經元的信息傳遞，也會影響神經元間的信息回路，因此突觸是維持神經功能的基礎，突觸損傷是神經功能障礙退化性疾病早期的、共同的病理改變［3］。突觸素1(synapsin1)是一種與突觸結構和功能密切相關的糖蛋白，幾乎所有中樞和周圍神經系統的突觸前終末內均發現有突觸素1［4］。它的表達可以反映突觸數量和大小的變化，是突觸終末的特異性分子標志物［5］。神經元包括胞體和突起，突起包括樹突和軸突，其中胞體和軸突結構和功能是一個整體，主要是營養和代謝以及傳導神經沖動。而樹突是主要接受傳遞來的信息。故本文通過研究不同濃度TGF-β1對神經元樹突生長以及突觸素1表達的影響，探討腦損傷后神經功能修復的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 多聚-L-賴氨酸(PLL)購自Sigma公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于Hyclone公司，B27、DMEM 培養基均購于 Gibco，Neurobasal購于Invitrogen公司。抗微管相關蛋白-2(Map2)、突觸素1(synapsin1)抗體均購自Millipore公司，羊抗小鼠Cy3、羊抗兔FITC均購自Chemicon公司。

1.1.2 實驗動物 健康清潔級ICR小鼠(8～10w)，購自安徽省試驗動物中心。在實驗前適應性喂養1w(自由飲食，晝夜均衡，溫度20～25攝氏度，濕度50%)，按雌雄比例2∶4于下午10:00合籠，次日上午6:00檢查雌鼠陰栓，查到陰栓者定為受孕第0天。

1.2 方法

1.2.1 小鼠小腦神經元的培養 在文獻［6］所述方法基礎上加以改進，將孕18d小鼠脫臼處死，75%酒精浸泡約8min，在無菌條件下解剖分離出胎鼠，之后沿胎鼠的口-耳連線剪開顱骨，取出腦組織，在顯微鏡下將腦膜及血管剝離，分離出雙側小腦半球以及蚓部，在Hank平衡鹽溶液中剪碎組織(約200下)，加入等量0.25%胰酶，在CO2培養箱37℃消化15～20min，每5min振搖1次，吹散組織成單細胞懸液，200目過濾，1000r/min離心4min后，用含10%FBS的DMEM培養基重懸計數，之后接種于200μg/ml PLL包被的96孔板中，接種密度為1×104培養液中含100U/L青霉素和100mg/L鏈霉素，置37℃、95%濕度、5%CO2培養箱內培養，12h后全量換液(含2%B27的Neurobasal)。培養48h后加入含阿糖胞苷(終濃度為5mg/ml)的培養基，抑制非神經元增殖。之后每3d半量換次含2%B27的Neurobasal。體外培養第7天進行以下各組實驗。

1.2.2 實驗分組 在體外培養第7天，加入不同濃度的 TGF-β1(1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml)，并設對照組，共分4組，每組15孔，對照組加入等體積的培養基。

1.2.3 熒光免疫細胞化學

1.2.3.1 應用Map2熒光染色觀察神經元樹突變化 加藥48h后，棄去培養液，PBS洗滌5min，用4%多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3次;用0.3%Triton和5%正常羊血清在濕盒內室溫封閉通透1h;應用Map2抗體(1∶500)在濕盒內室溫孵育1h后轉至4℃冰箱過夜;次日PBS洗3次，洗去一抗，用羊抗兔FITC在濕盒內室溫避光孵育3h，染色結束應用顯微鏡觀察樹突長度變化。

1.2.3.2 應用突觸素1抗體熒光染色測量突觸素1的表達 除用突觸素1抗體代替一抗外，其余步驟同1.2.3.1，染色結束后應用多功能酶標儀測量熒光強度值。

1.2.4 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察以及圖像分析 細胞經Map2免疫熒光標記后，應用Olympus IX71和Olympus DPCam Camera Capture Support系統捕獲圖像(200×)。同批次實驗，各熒光通道均設置固定的曝光時間，每次每組設2個復孔，每個復孔隨機選取4個相同面積的非重復視野，試驗重復2次。利用SPOT軟件固定標尺，測量每孔可辨所有神經元突起的長度，取平均值進行比較。

1.2.5 多功能酶標儀檢測突觸素1熒光強度值 在同樣曝光時間的條件下，吸收波長為485±20、激發波長為528±20時讀板，每孔的熒光強度值減去周邊對照孔的熒光強度值為突觸素1的熒光強度值，計算平均數，按均數±標準差±s)表示。

2 結果

2.1 TGF-β1 對神經元的影響

2.1.1 通過形態學觀察不同濃度 TGF-β1對神經元的影響 從形態學觀察可發現，1ng/ml的TGF-β1就表現出一定程度的促生長作用，培養的神經元突起增長，隨著TGF-β1濃度的加大，促進神經元生長的程度也加大，10ng/ml TGF-β1組能夠明顯促突起生長并能夠在較長距離形成神經元間網絡，并表現出一定的劑量依賴性(見圖1)。

2.1.2 通過標尺測量，觀察不同濃度TGF-β1對樹突生長的影響 通過測量可以更直觀地觀察不同濃度TGF-β1對神經元突起長度的影響，10ng/ml TGF-β1 組、5ng/ml TGF-β1 組及1ng/ml TGF-β1 組突起長度的測量平均值分別為:218.3 ±13.5、164.3 ±7.49、106.2 ±5.5，與對照組(63.7 ±7.8)相比，明顯增長，顯示有統計學差異(P＜0.05)。3個劑量組進行兩兩比較后發現也均有統計學差異(P＜0.05)，故說明TGF-β1作用與劑量存在一定依賴性。

2.2 TGF-β1 促進突觸素1 增多

2.2.1 從形態學觀察不同濃度 TGF-β1對突觸素1表達的影響 可見隨著TGF-β1濃度的增加，突觸顆粒明顯增多，熒光強度增強，密度增加(見圖2)。

2.2.2 應用酶標儀檢測熒光強度值 TGF-β1在1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml濃度下檢測突觸素 1 的熒光強度值分別為 21940.7 ±870.0、38450.0 ±559.1、46067.5 ± 1303.5，較對照組(17608.3 ±1389.3)顯著增強，有顯著統計學差異(P＜0.01)。3個劑量組進行兩兩比較后發現也均有明顯差異(P＜0.01)，說明TGF-β1可以促進突觸素1表達的增多，并呈現一定的劑量依賴性。

3 討論

轉化生長因子(TGF-β)家族由一個龐大的結構相關的多個多肽生長因子組成。哺乳動物主要有TGFβ1、TGFβ2、TGFβ33 種亞型，TGF-β1 參與體內多種病理生理過程，調節細胞生長分化，在損傷修復中起重要作用。大量研究顯示，在許多腦損傷疾病中，神經系統功能損傷后，特別是在腦血管疾病以及脊髓疾病中，均可發現內源性TGF-β1明顯增多，并參與神經系統病理修復過程［7～9］。為了研究TGF-β1對神經功能修復的可能機制，我們應用不同濃度外源性TGF-β1對體外原代培養的小腦神經元細胞進行觀察。MAP2是標記神經元樹突的主要標記物，亦是控制神經突起形態的重要分子，其中包括神經突起生長的起始過程［10］。本研究發現不同濃度的TGF-β1均可以促進神經元樹突生長，并呈現一定的劑量依賴性。突起的延長在神經功能中起重要的作用，可以促進更多神經元交織成網，促進信息傳導，以及促進與遠距離神經元信息傳導。同時樹突上樹突棘可能隨著樹突延長而增多，樹突棘是軸突與樹突接觸的主要部位，使得神經元的信息接受面積大為擴大，進一步促進神經功能的恢復。

大腦約有上億個神經元，所有神經元間的信息傳遞都是依賴突觸完成的，突觸傳遞是神經元之間的聯絡方式，主要是由突觸前神經元調控突觸后神經元的活動。突觸素1是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質，位于突觸前膜的表面。突觸素的減少可導致神經系統信息的傳遞、加工和儲存出現障礙［11，12］。因此突觸素不僅是突觸囊泡和突觸前膜的標記，也可作為突觸功能性標記［13］。有研究表明突觸素1不僅參與了調節神經遞質的釋放，而且參與了神經元突起的延伸、神經元極性的建立以及突觸的形成和維持［14］。本研究中我們同樣應用免疫熒光的方法標記突觸素1，并觀察到隨著TGF-β1濃度的增加，突觸素1表達明顯增多、增強，同樣也呈現一定劑量依賴性。突觸素1表達增多可反映突觸數目的增多和突觸連接及突觸傳導的增多，因而可促使神經遞質的調節釋放，更有利于促進神經功能恢復。突觸素1可促進突起的生長，有實驗發現，一些細胞因子可以通過PKA磷酸化突觸素的一個氨基酸殘基而打開神經元突起延伸的開關［15，16］，同時另有文獻報道TGF-β1可促進突觸素1磷酸化［17］。我們認為TGF-β1是否能通過促使突觸素1的增多以及其磷酸化，從而啟動神經元突起延伸的開關值得進一步研究。

綜上所述，本實驗證明了TGF-β1可以促進體外培養原代小腦神經元樹突生長并呈現一定劑量依賴，同時TGF-β1也可促進突觸素1表達的增多。機體在腦損傷后可能是由于內源性TGF-β1增加，使得樹突長度增長以及突觸數目增多，從而使更多神經元之間網絡形成、加快信息傳遞，促進神經功能修復。這為外源性TGF-β1應用于腦損傷的康復治療提供了實驗依據。

圖1 形態學觀察不同濃度TGF-β1對神經元突起長度的影響(bar=100μm)

圖2 不同濃度TGF-β1對synapsin1表達的影響(bar=100μm)

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