短暫性腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受大鼠VEGF和Ang-1的表達(dá)變化

孫順昌， 王國(guó)峰， 劉伯芹， 董 濱， 趙玉芳， 趙仁亮

短暫性腦缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IP)可誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)作用，抵御其后發(fā)生的較嚴(yán)重的甚至致死性腦缺血事件，減輕缺血組織病變程度，誘發(fā)腦缺血耐受［1］(ischemic tolerance，IT)。這為機(jī)體內(nèi)源性抗缺血缺氧損害的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供了新的思路，但是，IT是一個(gè)多機(jī)制參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，目前對(duì)IT的發(fā)生機(jī)制及誘發(fā)神經(jīng)保護(hù)的最佳時(shí)間窗尚無(wú)定論。大量研究表明［2］，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血管生成素-1(Ang-1)在缺血性腦損傷過(guò)程中扮演重要角色。腦缺血后，VEGF和Ang-1不僅通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、參與血管生成，其在神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)發(fā)生等方面也發(fā)揮了重要作用，但目前關(guān)于VEGF和Ang-1在IT機(jī)制中的研究很少。

本研究通過(guò)建立局灶性預(yù)缺血誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受模型，動(dòng)態(tài)檢測(cè)缺血預(yù)處理后再灌注不同時(shí)間窗VEGF及Ang-1的表達(dá)變化，并探討其在內(nèi)源性腦保護(hù)中的作用機(jī)制，從而為缺血性腦血管病的治療提供了一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年健康雄性Wistar大鼠99只，體重250～300g，清潔級(jí)，由青島市藥物檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成以下3組:(1)缺血預(yù)處理組(IP，45只)，預(yù)缺血10min后按不同的再灌注時(shí)間分為5個(gè)亞組，分別于再灌注1、3、7、14、21d后給予2h大腦中動(dòng)脈阻塞，再灌注22h后處死;(2)非缺血預(yù)處理組(NIP，45只)，分5個(gè)亞組，假手術(shù)代替預(yù)缺血(即僅暴露頸總動(dòng)脈及分叉處，不插線阻斷MCA)，在假手術(shù)后按前述不同時(shí)間點(diǎn)給予2h MCAO，再灌注22h后處死;(3)對(duì)照組(9只)，兩次均為假手術(shù)，即兩次均僅給予暴露頸總動(dòng)脈及分叉處，與以上兩組的1d亞組同時(shí)間處死。

1.2 模型制備 采用由 Zea-Longa［3］改進(jìn)的MCA二次線栓法。經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動(dòng)脈插線18.5±2mm，阻斷MCA，10min后將線栓退出至頸外動(dòng)脈(ECA)并埋于皮下，完成缺血預(yù)處理。在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)用相同方法再次造成MCAO，缺血2h后將線栓抽出至ECA，形成第二次再灌注，22h后處死。動(dòng)物清醒后觀察其行為和神經(jīng)癥狀，以動(dòng)物清醒后出現(xiàn)右前肢不能伸展、爬行時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈并存活至規(guī)定時(shí)間點(diǎn)作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。各組動(dòng)物術(shù)中均用白熾燈使其肛溫維持在37℃ ±0.5℃左右，術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

1.3 神經(jīng)行為功能評(píng)分 按 Menzies等［4］級(jí)評(píng)分法對(duì)其神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分:無(wú)明顯功能缺損為0分;提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢屈曲為1分;拉尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢的抓力減弱為2分;可向各方向自發(fā)運(yùn)動(dòng)而僅當(dāng)拉尾時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為3分;自發(fā)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為4分。

1.4 TTC染色 每組隨機(jī)選取4只大鼠，快速斷頭取腦，距額極2mm向后連續(xù)等距切取5個(gè)冠狀腦片，間距2mm，37℃水浴，避光、體積分?jǐn)?shù)0.01TTC磷酸緩沖溶液中染色。正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色。逐層拍照后，用Adobe PhotoShop CS計(jì)算各層面梗死面積。梗死體積=各層梗死面積之和×層間隔。

1.5 VEGF、Ang-1蛋白的檢測(cè) 采用SABC免

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組大鼠無(wú)神經(jīng)功能損傷癥狀，神經(jīng)功能評(píng)分為0分。其余兩組大鼠均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙。其中，NIP組各亞組間評(píng)分無(wú)明顯差異，IP組各亞組評(píng)分不盡相同，但其差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較顯示，IP組1、3、7d亞組大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分明顯低于 NIP 組(t=2.440 ～4.690，P=0.027 ～0.000)(見(jiàn)表1)。

2.2 對(duì)照組TTC染色腦組織呈均勻紅色，無(wú)梗死灶。NIP組與IP組腦組織染色均見(jiàn)白色缺血灶，主要位于額、頂、顳葉皮質(zhì)，紋狀體及海馬區(qū)亦可見(jiàn)缺血灶(見(jiàn)圖1)。NIP組各亞組間梗死體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IP組1、3、7d亞組梗死體積較14、21d亞組減小，其中以3d亞組梗死體積減小最為明顯。IP組1、3、7d亞組梗死體積較NIP組的相應(yīng)亞組明顯減小(t=7.947 ～10.587，P=0.000)(見(jiàn)表2)。

2.3 對(duì)照組未見(jiàn)有明顯VEGF陽(yáng)性表達(dá)。NIP組與IP組可見(jiàn)較多的VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，主要分布于缺血灶及周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及微血管內(nèi)皮細(xì)胞，胞漿棕黃色，著色明顯(見(jiàn)圖2)。其中，VEGF在IP后1d即出現(xiàn)明顯升高，持續(xù)至7d，明顯高于NIP組的相應(yīng)亞組，且高峰出現(xiàn)在IP后 3d(t=2.718 ～11.479，P ＜0.05)(見(jiàn)表3)。

2.4 正常對(duì)照組、NIP組與IP組均發(fā)現(xiàn)Ang-1陽(yáng)性表達(dá)，主要分布于皮質(zhì)、紋狀體區(qū)的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等，陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒(見(jiàn)圖3)。其中，IP組7d亞組Ang-1蛋白表達(dá)明顯高于NIP組的相應(yīng)亞組(t=2.699～3.173，P ＜0.05)(見(jiàn)表4)。疫組織化學(xué)染色法，DAB顯色，光鏡下觀察，胞漿出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性著色。所有切片均在同一光強(qiáng)度和同一放大倍數(shù)下進(jìn)行，在低倍鏡下選擇觀察視野，皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)取4個(gè)象限選擇視野，然后在高倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為功能評(píng)分± s，n=9)

表1 各組大鼠神經(jīng)行為功能評(píng)分± s，n=9)

與NIP組比較*P＜0.05

組別2.22 ±0.672.22 ±0.60 1d 3d 7d 14d 21d NIP IP 2.11 ±0. 21.22 ±0.44*2.33 ±0.501.11 ±0.60*2.22 ±0.971.33 ±0.50*2.33 ±0.861.89 ±0.60

表2 各組大鼠腦組織梗死體積比較 ± s，n=4)

表2 各組大鼠腦組織梗死體積比較 ± s，n=4)

與 NIP 組比較*P ＜0.001;IP 組內(nèi)1、3、7d亞組與14、21d亞組相比#P ＜0.05

NIP IP 219.9 ±11.2161.2 ±6.9*#218.6 ±13.0134.9 ±9.0*#221.3 ±14.2142.9 ±13.7*#206.4 ±15.4187.1 ±8.0213.8 ±19.9199.1 ±11.5

表3 各組大鼠缺血灶及周邊區(qū)VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá)χ ± s，n=5)

表3 各組大鼠缺血灶及周邊區(qū)VEGF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá)χ ± s，n=5)

與 NIP 組比較*P ＜0.05;IP 組內(nèi)同一區(qū)域3、7d亞組與1、14、21d亞組相比#P ＜0.05

NIP IP皮質(zhì)紋狀體皮質(zhì)紋狀體17.30 ±2.4518.62 ±2.2121.10 ±1.94*24.54 ±2.53*16.82 ±2.5319.10 ±2.4131.12 ±2.30*#35.84 ±2.19*#16.52 ±2.1619.42 ±2.5926.98 ±2.36*#31.36 ±2.85*#17.10 ±2.6418.98 ±2.6819.70 ±2.8822.08 ±2.3816.98 ±2.4119.12 ±2.3417.80 ±1.9220.84 ±2.35

表4 各組大鼠缺血灶及周邊區(qū)Ang-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá) ± s，n=5)

表4 各組大鼠缺血灶及周邊區(qū)Ang-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá) ± s，n=5)

與NIP組比較*P＜0.05

NIP IP皮質(zhì)紋狀體皮質(zhì)紋狀體22.34 ±2.1323.06 ±2.0722.68 ±1.8623.70 ±2.8423.12 ±1.8024.10 ±1.8823.42 ±2.2824.82 ±2.6922.82 ±1.9123.68 ±2.0626.22 ±2.07*28.04 ±2.28*22.60 ±2.3724.66 ±2.2224.28 ±2.5025.32 ±1.6323.08 ±2.4923.80 ±2.5123.12 ±2.4224.04 ±2.28

圖1 腦梗死體積TTC染色

3 討論

本研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷后，動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，缺血損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞呈核固縮、破碎等現(xiàn)象，而通過(guò)IP，梗死灶中心區(qū)明顯減小，組織水腫程度減輕，周圍區(qū)結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)細(xì)胞明顯增多;IP組的1、3、7d亞組梗死體積較同時(shí)間點(diǎn)NIP組的相應(yīng)亞組明顯降低，其動(dòng)物神經(jīng)行為功能評(píng)分亦明顯低于同時(shí)間點(diǎn)NIP組的相應(yīng)亞組，說(shuō)明通過(guò)10min IP可降低腦梗死體積，促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)，有效降低其后腦缺血事件的嚴(yán)重性，誘發(fā)IT的發(fā)生，其缺血耐受產(chǎn)生的高峰期出現(xiàn)在預(yù)處理后3d，持續(xù)1～7d。

IT機(jī)制發(fā)生復(fù)雜，包括細(xì)胞防御機(jī)制的激活、細(xì)胞因子的參與以及興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)平衡的改變等［5］。VEGF是一種特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)有絲分裂原，也是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的增加血管通透性物質(zhì)之一，選擇性地直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞膜上酪氨酸受體VEGFR1和VEGFR2，誘發(fā)ECs增殖、遷移以及細(xì)胞間的相互作用和管腔的形成，促進(jìn)新生血管形成。VEGF的表達(dá)受許多因素的調(diào)控，缺血或缺氧是誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的最主要的因素［6］。Mu等［7］認(rèn)為在缺血性腦損傷半暗帶低氧區(qū)，低氧激活了HIF-1α的表達(dá)，激活的HIF-1α誘導(dǎo)VEGF過(guò)量表達(dá)，同時(shí)VEGF刺激了其受體的表達(dá);VEGF與其受體結(jié)合后，一方面促使微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，促使新血管生成，改善局部血供，并保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不發(fā)生程序性死亡，從而減輕缺血性腦損傷;另一方面，在腦缺血急性期，VEGF對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞等還具有直接的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用［8］，并能通過(guò)直接或間接抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而保護(hù)神經(jīng)元，從而進(jìn)一步促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，NIP組與IP組均可見(jiàn)較多的VEGF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，分布于缺血灶及周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及微血管內(nèi)皮細(xì)胞，且VEGF蛋白在IP后1d即出現(xiàn)升高，盡管組間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在IP后3d時(shí)達(dá)到高峰，持續(xù)7d左右，同時(shí)IP組1、3、7d亞組VEGF陽(yáng)性表達(dá)明顯高于NIP組的相應(yīng)亞組，IP誘導(dǎo)的缺血及周邊區(qū)VEGF表達(dá)變化與腦缺血耐受的時(shí)間基本一致，提示VEGF在腦缺血耐受中發(fā)揮了重要作用。如果能在缺血性腦損傷早期誘導(dǎo)VEGF及其受體大量表達(dá)可能為缺血性腦損傷患者的治療提供新的線索。Ang-1是ECs特異性受體酪氨酸激酶Tie-2的配體，對(duì)ECs具有強(qiáng)力趨化作用，這種趨化作用能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞出芽遷移并形成管狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)Ang-1還能誘導(dǎo)纖溶酶的釋放，并抑制金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)的分泌，提高基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和TIMP的比例，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞遷移創(chuàng)造條件。在腦缺血后，Ang-1可促進(jìn)缺血腦組織周圍側(cè)支循環(huán)形成、穩(wěn)定血管、延緩血管退化;并加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連結(jié)，維持血腦屏障(BBB)的完整性，有效改善缺血腦組織血流灌注，并能直接抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺血半暗帶神經(jīng)元，改善腦缺血后神經(jīng)功能預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)中，Ang-1在正常對(duì)照組、NIP組與IP組均有所表達(dá)，其中，僅IP組7d亞組Ang-1蛋白表達(dá)明顯高于NIP組的相應(yīng)亞組，但腦缺血耐受在IP后1d即開(kāi)始出現(xiàn)，產(chǎn)生的高峰期在IP后3d，持續(xù)至7d。說(shuō)明在腦缺血耐受早期階段并未出現(xiàn)Ang-1的明顯升高，Ang-1可能主要作用于腦缺血耐受的后期階段。

圖2 VEGF蛋白表達(dá)

圖3 Ang-1蛋白表達(dá)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，短暫性腦缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)腦缺血耐受的產(chǎn)生，VEGF在預(yù)處理后產(chǎn)生腦缺血耐受的相應(yīng)時(shí)間窗內(nèi)表達(dá)有所增加，Ang-1可能在腦缺血耐受后期階段發(fā)揮重要作用。

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