載脂蛋白J在實驗性腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)的表達(dá)

石 磊， 孫魯寧， 顧鵬毅， 盧 杰， 李 琳， 黃長榮， 費 菲， 王 玨

Apo-J是1989年由De Silva等在研究人血漿HDL所含膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白，并按ABC法命名為載脂蛋白J［1］。國內(nèi)外研究證實:Apo-J在轉(zhuǎn)運脂質(zhì)、調(diào)節(jié)補體功能、促進(jìn)精子成熟、保護(hù)細(xì)胞、延緩細(xì)胞凋亡等生理及疾病過程中發(fā)揮重要作用，對細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的平衡意義重大［2］。缺血再灌注是缺血性腦血管病所致?lián)p傷的過程，既然Apo-J具有延緩細(xì)胞凋亡的作用，那么，在缺血再灌注的神經(jīng)元損傷過程中，其mRNA及蛋白本身的表達(dá)是否升高?是否與延緩細(xì)胞凋亡有關(guān)?本文即進(jìn)行此項研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及方法 清潔級成年Wistar大鼠150只，隨機(jī)分為:(1)NC組:10只，無任何手術(shù)操作;(2)IR組:70只，造腦IR模型;(3)SO組:70只，造模中沿左頸內(nèi)動脈向大腦中動脈進(jìn)線長度9mm，其余步驟同IR組。IR組、SO組按拔線后3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d 分為7 個亞組，每亞組5 只。

1.2 左側(cè)腦IR模型的建立 按Zea Longa線栓法［3］制作左腦缺血再灌注模型，步驟略。栓塞90min后抽出魚線實現(xiàn)再灌注。SO組送線長度9mm，余步驟同IR組。動物清醒后用Bederson法［4］進(jìn)行肢體運動功能的評分:0分，無任何功能缺失;1分，提尾倒立時右前肢屈曲;2分，體征如1分，伴右側(cè)肢體對外側(cè)推力的抵抗力下降;3分，體征如2分，伴行走時明顯向右側(cè)轉(zhuǎn)圈。評1～3分的動物列入研究。

1.3 制作腦標(biāo)本

1.3.1 RT-PCR用標(biāo)本的制作 于預(yù)定時間將大鼠快速斷頭取腦，去掉嗅球、小腦、低位腦干，余腦正中線作矢狀切開;左腦首先切取大腦中動脈的供血區(qū)作為再灌注區(qū)，它的前面為再灌注前區(qū)，后面為再灌注后區(qū)。

1.3.2 制作免疫組化及TUNEL標(biāo)本 于預(yù)定時間麻醉IR組大鼠，4%多聚甲醛灌注，取腦后固定。根據(jù)預(yù)實驗TTC及HE染色結(jié)果及大腦中動脈供血范圍，在左腦再灌注邊緣區(qū)選3個位點(包括海馬區(qū)及隨機(jī)選的另外兩個位點)。每個位點按冠狀面向后切取各12張5μm切片，按HE、免疫組化、TUNEL的順序留用，4次循環(huán)。SO組、NC組在IR組的相同區(qū)域取材。

1.4 腦組織總RNA提取、Real time RT-PCR各腦區(qū)的腦組織勻漿，各取100mg，用總RNA提取試劑盒RNAiso TM Plus(TaKaRa)提取各腦區(qū)的總RNA，檢測RNA的濃度及純度。使用SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa的實時RT-PCR試劑盒)在美國通用公司的ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。以O(shè)ligo-DT primer為逆轉(zhuǎn)錄引物行逆轉(zhuǎn)錄;用primer 5.0設(shè)計 Apo-J及內(nèi)參照 β-actin的上下游引物。Apo-J上游引物:5’-CCG GAA GTG TGC AAC GAG A-3’，下游引物:5’-GGG AGA GAG GCA TGA TGT TGC-3’;β-actin 的上游引物:5’-AGA AGC TGT GCT ACG TGG CG-3’，下游引物:5’-AGG AAG GAG GGC TGG AAC A-3’。進(jìn)行兩步法PCR擴(kuò)增，同時擴(kuò)增內(nèi)參照及Apo-J的cDNA。程序如下:第一步:預(yù)變性，95℃30s×1個循環(huán);第二步:(95℃5s+60℃34s)×40個循環(huán);第三步:融解。進(jìn)行PCR定量前檢測內(nèi)參照及Apo-J的PCR擴(kuò)增效率，證實為相同。實驗結(jié)果分析:反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線及融解曲線，對Apo-J mRNA進(jìn)行相對定量分析采用比較 2－ΔΔCt法，取 Apo-J/β-actin 的比值為Apo-JmRNA的相對表達(dá)量。

1.5 HE染色、免疫組化、TUNEL 用光學(xué)顯微鏡觀察及照相，每個位點不重復(fù)隨機(jī)選取10個高倍視野觀察。

1.5.1 HE 染色略。

1.5.2 免疫組化 用 SABC法，設(shè)立陰性對照。山羊抗大鼠Apo-J抗體購自Sigma公司，按試劑盒說明書操作。切片用顯微圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(Media Cyberbetics，美國)分析陽性表達(dá)的平均光密度(MD)。

1.5.3 TUNEL檢測 試劑盒購自羅氏公司，按說明書操作，切片圖像用Image-Pro Plus 6.0分析，計算凋亡指數(shù)(AI)，AI=(視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)/視野中的細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6 統(tǒng)計分析 應(yīng)用單因素方差分析，相關(guān)的比較因素包括:造模方式(NC、SO、IR)、造模后時點(以下簡稱時點)、腦區(qū)，分別進(jìn)行多次分析。NC組、每個時點的SO亞組及IR亞組(時點亞組)在一起比較，NC組樣本無時點的區(qū)別，可以加入各時點亞組進(jìn)行比較。當(dāng)出現(xiàn)總體差異時，組間兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異具有顯著性，P＞0.05為差異無顯著性。用SPSS13.0統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 Apo-JmRNA的表達(dá) (1)在相同腦區(qū)和時點的不同造模方式的表達(dá)差別:再灌注前區(qū):各時點中IR組、NC組、SO組間無總體差異(P＞0.05);再灌注區(qū):各時點中均為IR組最高(NC、SO組分別與 IR 組比較*P ＜0.01，＊＊P ＜0.05)，NC 組、SO組間無差別(P＞0.05);再灌注后區(qū):在各時點3組間無總體差異(P＞0.05)。(2)在相同腦區(qū)和造模方式的不同時點的表達(dá)差別:再灌注前區(qū):IR組、SO組各自的亞組間比較，無總體差異(P＞0.05);再灌注區(qū):SO各亞組間無差異(P＞0.05)，IR組中1d亞組最高，由3h～1d亞組表達(dá)漸增加，由1～7d亞組表達(dá)漸降低(其它各亞組與1d亞組比較△P＜0.01，△△P ＜0.05);再灌注后區(qū):IR 組、SO 組各自的亞組間比較，無總體差異(P＞0.05)。(3)在相同造模方式和時點的不同腦區(qū)的表達(dá)差別:IR組:在各時點再灌注區(qū)均高于再灌注前區(qū)、后區(qū)(前區(qū)及后區(qū)與再灌注區(qū)比較▽P＜0.01);SO組:各亞組間無總體差異(P＞0.05)。以上可見，在IR組的再灌注區(qū)Apo-JmRNA的表達(dá)增加，并且在1d亞組達(dá)峰值(見表1)。

2.2 再灌注區(qū)周邊HE染色觀察神經(jīng)元改變(圖像略)(1)NC組、SO組的神經(jīng)元無明顯損傷，偶見細(xì)胞周圍水腫、胞核皺縮。(2)IR組:3h亞組可見約40%的神經(jīng)元出現(xiàn)周圍水腫、染色加深;6h亞組細(xì)胞周圍水腫較3h組加重，并可見細(xì)胞周圍空泡改變、約25%出現(xiàn)胞核皺縮;12h亞組水腫情況減輕，但胞核皺縮增多;1d亞組細(xì)胞損傷最重，約90%細(xì)胞出現(xiàn)胞核皺縮、周圍空泡改變;3d、5d、7d亞組胞核皺縮、細(xì)胞周圍空泡改變依次減輕。

2.3 再灌注區(qū)周邊Apo-J的免疫組化 (1)相同時點、不同造模方式間的比較:在每個時點，IR亞組均高于SO亞組、NC組(P＜0.01);SO亞組、NC組間未見差異(P＞0.05)。(2)相同造模方式、不同時點間的比較:IR各亞組中，1d亞組最高(其它各亞組與其比較，P＜0.01);SO各亞組間未見差異(P＞0.05)(見表2、見圖1)。

2.4 再灌注區(qū)周邊的TUNEL檢測 (1)相同時點、不同造模方式間的比較:在每個時點，IR亞組的凋亡指數(shù)均高于SO亞組、NC組(P＜0.01)，SO亞組、NC組間未見差異(P＞0.05)。(2)相同造模方式、不同時點間的比較:IR各亞組中，1d亞組的凋亡指數(shù)最高(其它亞組與其比較，P＜0.01);SO各亞組間未見差異(P＞0.05)(見表3、見圖2)。

表1 Apo-JmRNA在左側(cè)再灌注區(qū)的表達(dá)

表2 Apo-J在再灌注周邊區(qū)的表達(dá)(MD)

表3 再灌注周邊區(qū)的TUNEL檢測結(jié)果(AI，%)

3 結(jié)論

實驗性腦缺血再灌注大鼠缺血再灌注區(qū)的Apo-J mRNA表達(dá)增加，于再灌注后1d最高;在再灌注區(qū)周邊Apo-J的表達(dá)增加，也是再灌注后1d最高，與該區(qū)域細(xì)胞凋亡程度的變化趨勢在再灌注后時間上是一致的。

4 討論

Apo-J是一種異二聚體的酸性糖蛋白，由α和β亞基通過二硫鍵相連而成。它分布于血漿HDL2(d=1.063 ～1.125g/ml)及 HDL3(d=1.125 ～1.21g/ml)中，但以極高密度脂蛋白(VHDL，d=1.21 ～1.25 g/ml)中含量最多［5］。Apo-J在哺乳動物不同組織和體液中廣泛存在，Apo-J mRNA除在肝臟含量較高外，腦、卵巢、睪丸含量亦較高;心、脾、肺、乳腺僅含少量Apo-JmRNA。肝臟是合成Apo-J的主要場所，但睪丸、卵巢、腦也能合成一定量的 Apo-J［6］。

Apo-J在許多人類疾病的病理過程中有表達(dá)，如動脈粥樣硬化、心肌梗死、腎小球腎炎、囊性腎病、腎小管損傷等。正常腦組織及腦脊液中均有Apo-J表達(dá)，在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如癡呆［7］、朊蛋白病、帕金森病、急性腦血管病、癲癇、多發(fā)性硬化、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、亨廷頓病［8］、艾滋病的神經(jīng)系統(tǒng)病變［9］等，Apo-J的表達(dá)均顯著增高，提示其可能在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中的表達(dá)增加，起到細(xì)胞保護(hù)作用。

腦缺血再灌注過程是缺血性腦血管病研究的熱點，既往該方面的研究多集中于造成缺血再灌注的腦損傷因素，包括神經(jīng)元內(nèi)Ca2+超載、興奮性氨基酸的毒性作用、氧自由基及脂質(zhì)過氧化、熱休克蛋白表達(dá)紊亂［10］、一氧化氮的神經(jīng)毒性作用［11］等。而在此損傷過程中腦內(nèi)的保護(hù)因素，國內(nèi)外研究匱乏，本實驗即是探索腦內(nèi)保護(hù)因素的一項研究。

在腦缺血再灌注損傷中，神經(jīng)元的死亡分為壞死、自噬和凋亡3種情況。壞死主要發(fā)生于缺血及再灌注的區(qū)域，以中心區(qū)最為明顯;而在缺血再灌注周邊區(qū)的細(xì)胞死亡形式主要表現(xiàn)為凋亡。在現(xiàn)代缺血性腦血管病的治療中，如何挽救缺血周邊區(qū)、缺血半暗帶的細(xì)胞免于死亡，是治療的焦點。本實驗觀察了缺血再灌注這一缺血性腦損害的缺血周邊區(qū)的保護(hù)因子Apo-J的表達(dá)，對缺血性腦血管病的治療是有指導(dǎo)意義。

本實驗研究發(fā)現(xiàn):在大鼠腦缺血再灌注區(qū)域Apo-JmRNA的表達(dá)由再灌注后3h～1d逐漸升高，于1d時達(dá)峰值，由1d～7d又逐漸降低;且再灌注周邊區(qū)Apo-J的表達(dá)趨勢與再灌注區(qū)域Apo-J mRNA的表達(dá)趨勢相同。同時，再灌注周邊區(qū)神經(jīng)元的凋亡增多時，Apo-J的表達(dá)也是增加的，在再灌注后1d神經(jīng)元的凋亡、Apo-J的表達(dá)達(dá)峰值。推測其可能機(jī)制是:隨著再灌注周邊區(qū)神經(jīng)元凋亡的增加，Apo-J的表達(dá)增加以保護(hù)細(xì)胞、減少細(xì)胞的凋亡。其后，隨著再灌注1d后細(xì)胞凋亡的減少，Apo-J的表達(dá)量也下降。而再灌注區(qū)域Apo-JmRNA表達(dá)的增加，明顯高于再灌注前區(qū)、后區(qū)，提示在再灌注區(qū)域隨著再灌注損傷的進(jìn)行，Apo-J的表達(dá)增加，以起到細(xì)胞保護(hù)作用。

Apo-J是如何進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)的呢?其機(jī)制目前尚未完全明確。國外的相關(guān)研究結(jié)果如下:體外實驗已證實其可與補體C5b-7結(jié)合，阻止補體C8及C9的激活，從而抑制由補體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解反應(yīng)。Apo-J的結(jié)構(gòu)與已知的其它載脂蛋白不同，但與補體蛋白的結(jié)構(gòu)相似。這些研究表明，Apo-J可能參與補體功能的調(diào)節(jié)［12］。另一個國外研究的結(jié)果［13］提示，Apo-J的細(xì)胞保護(hù)作用與抑制補體參與的炎癥反應(yīng)有關(guān)，在其中Apo-J的調(diào)控作用包括:(1)充當(dāng)抗炎介質(zhì);(2)Apo-J的局部表達(dá)可能有媒介的作用;(3)Apo-J可與免疫球蛋白相互作用，能抑制補體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。在Xie Z等［14］的一項腦微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞研究中，發(fā)現(xiàn)Apo-J的表達(dá)可以緩解微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的慢性炎癥及神經(jīng)元的毒性效應(yīng)。在Legleiter J等［15］關(guān)于神經(jīng)元保護(hù)因素的研究中，發(fā)現(xiàn) Apo-J與Apo-E同樣，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富，通過抑制補體參與的炎癥反應(yīng)起細(xì)胞保護(hù)作用。Calero等［12］在其研究中作出總結(jié):Apo-J在一系列腦損傷中濃度上調(diào)是對神經(jīng)元的一種保護(hù)反應(yīng)，這種保護(hù)反應(yīng)有4種機(jī)制:(1)Apo-J可作為反凋亡信號;(2)Apo-J具有抗氧化作用;(3)抑制補體蛋白形成膜攻擊復(fù)合體，從而抑制炎癥;(4)和一些炎癥相關(guān)蛋白結(jié)合，從而抑制這些蛋白造成的炎癥反應(yīng)。

那么，進(jìn)一步說，Apo-J是如何延緩神經(jīng)元凋亡的發(fā)生呢?在Degagher等［16］的一項關(guān)于神經(jīng)元凋亡的研究中，發(fā)現(xiàn)在損傷細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)凋亡的Bax蛋白表達(dá)增加時，細(xì)胞內(nèi)線粒體中Apo-J的表達(dá)也增加，呈聚集狀態(tài)，并起到保護(hù)細(xì)胞的作用。在本實驗中，也發(fā)現(xiàn)Apo-J在再灌注周邊區(qū)的表達(dá)量與神經(jīng)元的凋亡指數(shù)成正比，提示表達(dá)增多的Apo-J可能起到延緩神經(jīng)元凋亡、保護(hù)缺血再灌注半暗帶的神經(jīng)元的作用。

總之，通過本實驗研究，可以發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷中，Apo-J起到了延緩再灌注周邊區(qū)、半暗帶神經(jīng)元凋亡的作用。該基礎(chǔ)研究結(jié)果再經(jīng)過一系列驗證后，或許可以應(yīng)用于臨床。由此，可以設(shè)計相應(yīng)的措施以增加缺血性腦血管病患者腦內(nèi)Apo-J的表達(dá)或抑制其降解，從而減少缺血再灌注產(chǎn)生的腦損傷，這有待于進(jìn)一步的基礎(chǔ)及臨床研究。

圖1 再灌注周邊免疫組化圖像

圖2 TUNEL染色結(jié)果

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