實時定量聚合酶鏈反應檢測人半翼基因在宮頸病變中的表達及意義

盧博奇，藺 莉

宮頸癌是婦科疾病中最常見的惡性腫瘤之一，每年有近30萬新發宮頸癌病例，總體5年生存率約為52%。發達國家如美國每年約有1萬例宮頸癌新發病例，而中國每年約有8～10萬例宮頸癌新發病例，死亡率位居中國女性癌癥的第二位［1］。宮頸癌近年來呈現年輕化趨勢，其發病機制尚不明確，但很多研究證明99%的宮頸癌組織中可檢出人乳頭瘤病毒(HPV)。目前普遍接受的觀點是:HPV是宮頸癌的主要致病因子［2－3］。然而在感染 HPV的婦女中，大多數可自行消退，僅少數婦女發展為持續性感染并進展為宮頸上皮內瘤樣變(CIN)甚至宮頸癌。但宮頸癌患者并非都有HPV的感染，說明在宮頸癌的發生過程中，還有其他一些因素發揮作用［4］。人半翼 (hWAPL)基因是近年來發現的與宮頸癌及HPV關系十分密切的一個基因［5－6］，研究表明hWAPL基因在宮頸癌中特異性高表達［6］。本研究在分子水平上采用實時熒光定量聚合酶鏈反應 (PCR)測定宮頸中hWAPL基因的表達水平，探討hWAPL基因表達與宮頸病變之間的關系，為探索宮頸癌的早期診斷方法提供理論依據。

1 資料和方法

1.1 研究對象 收集2007年3月—2009年1月首都醫科大學附屬北京友誼醫院門診行陰道鏡檢查、取材并經病理檢查證實的宮頸病變標本共100例，患者均未經任何物理、化學、放射治療及手術治療，包括慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌各20例。病理結果均由北京友誼醫院病理科證實。陰道鏡下取材的宮頸組織先保存于液氮中，后轉移至－80℃冰箱保存。

1.2 試驗步驟

1.2.1 總RNA提取 每個樣本取凍存組織50～100 mg，使用總RNA提取試劑盒〔天根生化科技 (北京)有限公司〕，用離心柱法進行總RNA提取。將RNA在1%瓊脂糖中進行電泳檢測其完整性，可見28S及18S兩條清晰條帶。

1.2.2 逆轉錄合成cDNA

1.2.2.1 引物設計及合成 根據Gene bank中hWAPL基因及β－actin基因 (看家基因)序列，應用Primer Express 3.0軟件設計引物，送上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下:hWAPL基因上游為GATAAGAGTGGAGAGTGGCAA，下游為ACCCAAGAAGTAGTGCTGTGT，產物長度194 bp;β－actin基因上游為TCAAGATCATTGCTCCTCCTG，下游為TCATAGTCCGCCTAGAAGCAT，產物長度160 bp。

1.2.2.2 cDNA第一鏈的合成 使用美國Promega公司MMLV逆轉錄酶，建立25 μl反應體系:M－MLV 5×緩沖液5 μl，dNTP混合物 (10 mM)3 μl，RNasin核糖核酸酶抑制劑1 μl，M － MLV 逆轉錄酶 1 μl，Poly(T) 引物 (10 μM)1 μl，總 RNA(1 μg/μl)1 μl，RNase － free H2O 13 μl; 反應條件:25℃ 5 min，37℃ 1 h，95℃ 10 min。cDNA用于PCR反應或保存于－20℃備用。

1.2.3 實時定量PCR檢測

1.2.3.1 標準曲線的制定 為校正定量過程中不同樣品RNA中mRNA含量的差異，選用β－actin基因作為內參照對RNA含量的變異進行校正。以cDNA為模板，β－actin基因為引物進行擴增，β－actin基因 PCR產物進行純化、連接轉化、提質粒，并對β－actin基因質粒原液進行定量，將此質粒原液作為標準曲線中最高的模板 (1011拷貝)，然后將其逐次10倍稀釋成1010、109、108、107、106、105、104和 103用于標準曲線的制作。

采用SYBR GreenⅠ熒光染料摻入法，進行實時定量PCR反應。每個樣品做兩個平行，并設有雙蒸水空白對照。

1.2.3.2 實時定量PCR反應 使用美國ABI公司的實時熒光定量PCR試劑盒，采用總體積15 μl反應體系:SYBR Green Master Mix 7.5 μl，去離子水 4.5 μl，上游引物 1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl。反應條件:25 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，共40個循環。以β－actin基因作為內參照進行PCR。PCR擴增完成后，采用計算機軟件 (7300 System Software Applied Biosystem)分析各反應的熒光強度，得出反應的臨界循環數 (CT)值并自動繪制β－actin的標準曲線，參照標準曲線，得出目的基因的相對反應起始拷貝數。hWAPL基因mRNA相對表達量=hWAPL基因拷貝數/β－actin基因拷貝數。

2 結果

2.1 hWAPL基因在慢性宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組及宮頸癌組中均有表達。逆轉錄合成的特異性hWAPL基因cDNA經常規PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在194 bp處有清晰條帶 (見圖1)。

圖1 逆轉錄合成hWAPL基因的cDNA PCR擴增電泳圖Figure 1 Electrophoresis of cDNA PCR amplification for Reverse transcription hWAPL

2.2 實時定量PCR結果

2.2.1 慢性宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和宮頸癌組中hWAPL基因mRNA相對表達量逐漸增多，5組比較，差異有統計學意義 (F=9.47，P=0.00)。其中CINⅢ組和宮頸癌組與慢性宮頸炎組、CINⅠ組、CINⅡ組3組比較差異均有統計學意義 (P＜0.05)，慢性宮頸炎組、CINⅠ組和CINⅡ組hWAPL基因mRNA相對表達量明顯低于宮頸癌組和宮頸癌組;宮頸癌組與CINⅢ組比較，差異無統計學意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 宮頸組織hWAPL mRNA相對表達量比較 (±s)Table 1 hWAPL mRNA expression in cervical lesions

表1 宮頸組織hWAPL mRNA相對表達量比較 (±s)Table 1 hWAPL mRNA expression in cervical lesions

注:*與CINⅢ組和宮頸癌組比較，P＜0.01;△與宮頸癌組比較，P＞0.05

mRNA慢性宮頸炎組 20 1.05±0.68組別 例數 hWAPL基因*CINⅠ組 20 3.05±1.57*CINⅡ組 20 4.48±2.25*CINⅢ組 20 8.71±7.70△宮頸癌組 20 10.49±9.82

2.2.2 實時定量PCR標準曲線和融解曲線 標準曲線相關系數0.996，＞0.99，標準點有5個，融解曲線顯示只有一個大峰，沒有引物二聚體。均證明引物設計準確，特異性好，產物擴增效率良好，定量結果可靠 (見圖2～4)。

圖2 標準曲線Figure 2 Standard curve

圖3 hWAPL融解曲線Figure 3 hWAPL dissociation curve

圖4 β－actin融解曲線Figure 4 β－actin dissociation curve

3 討論

半翼 (WAPL)基因是1977年發現的果蠅體內的X連鎖基因序列［7］，是果蠅體內調節異染色質組織的基因產物。hWAPL基因是果蠅體內WAPL基因在人體內的同源序列，定位于10q23.2，編碼一種聚合錨定蛋白，有利于其在分裂前期適時從染色體臂解離。Hela細胞中WAPL基因的缺失導致分裂前中期同源染色體細胞瞬間聚集，其中兩個姐妹染色單體的解離存在嚴重的缺陷。當兩個姐妹染色單體彼此聚合的時候，染色質中心軸的聚合蛋白呈現高水平。聚合蛋白的減少減輕了WAPL基因缺失表型，并且使人動點蛋白 (Sgo1)和粘連蛋白(Esco2)缺失的細胞中過早分離的姐妹染色單體還原［8］。相反的，WAPL基因的過度表達反而使姐妹染色單體過早解離，并且擾亂有絲分裂和胞質分裂，從而誘導染色體的不穩定性，促進腫瘤的形成［5－9］。Oikawa等［10］從良性宮頸上皮、宮頸非典型增生上皮和浸潤性宮頸癌中分離出并確定了WAPL突變型，并利用Northern印跡技術對宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、結腸癌及其相應的正常組織中的hWAPL基因mRNA表達水平進行檢測，發現相對于其他癌組織及其相應的正常組織，宮頸癌中hWAPL基因mRNA表達升高十分明顯［5］。利用免疫組化技術對正常宮頸上皮、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌組織中hWAPL的表達進行對比，發現hWAPL基因在所有檢測的標本中均有表達，但在正常宮頸上皮中的表達僅限于基底層;在CINⅠ～Ⅲ級和宮頸癌組織中的表達逐漸增加。

Oikawa等［5］還用血凝素 (HA)標記的hWAPL表達載體(HA－hWAPL 3T3)或HA表達載體 (HA－3T3)轉染宮頸癌NIH3T3細胞，然后比較HA－hWAPL 3T3和HA－3T3細胞在裸鼠中生成腫瘤的能力。結果發現所有注射HA－hWAPL 3T3細胞的裸鼠均在注射10 d后有腫瘤生成，而在HA－3T3注射的裸鼠體內無一例發生腫瘤，表明hWAPL具有癌基因的特征。

曹利仙等［11］在hWAPL基因序列中選取了兩處作為干擾靶點，將含9個堿基環結構的退火雙鏈與含U6啟動子的真核表達載體相連，成功構建針對WAPL基因的shRNA長效真核表達載體。經酶切和測序鑒定表明成功構建了3個pGenesilhwAPL－shRNA，采用脂質體法轉染宮頸癌CaSki細胞后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光蛋白表達。實時定量PCR檢測結果表明，篩選到的短鏈WAPL基因siRNA能有效抑制內源hWAPL基因的表達。說明該shRNA真核表達載體能特異地降低宮頸癌CaSki細胞hWAPL基因mRNA水平，起到轉錄后基因沉默作用，抑制宮頸癌細胞惡性增殖。

本研究應用實時熒光定量PCR法檢測慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宮頸癌組織中hWAPL基因mRNA表達量，結果表明，在所有實驗組中均有hWAPL基因mRNA表達，并且隨著宮頸病變程度的加重，hWAPL基因mRNA表達量逐漸上升，在宮頸癌組中的表達明顯高于宮頸炎組、CINⅠ組和CINⅡ組，說明hWAPL基因在宮頸癌的發生、發展中可能起著極其重要的作用。本研究結果顯示，CINⅢ組和宮頸癌組中hWAPL基因mRNA表達量無明顯差異，但在臨床的診療中，CINⅢ和宮頸癌的治療方法的選擇和隨訪均有較大的差別，能否將hWAPL基因mRNA表達量的高低作為判斷宮頸病變程度的可靠指標，仍需進一步的研究來證實，hWAPL基因在宮頸癌中的具體作用機制將成為以后研究的主要任務。

1 黃莫婉，馬英.宮頸癌研究新進展 ［J］.重慶醫學，2006，35(23):2185－2187.