左歸丸與右歸丸對EAE大鼠APP及GAP-43表達的影響1)

王義周,寇 爽,閆翠翠,鄭 琦,張 琪,趙 暉,王 蕾

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘的自身免疫性疾病。其病理特點是炎癥引起的脫髓鞘和軸突損傷等[1]。實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis,EAE)是目前公認的研究MS較為理想的動物模型[2]。前期臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn),左歸丸與右歸丸對MS病人及EAE大鼠具有較好的作用[3-6]。本實驗利用Western-blot和實時熒光定量RT-PCR檢測技術,進一步觀察了兩方對EAE大鼠腦白質和脊髓組織中與神經(jīng)軸突損傷和再生相關的淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)及神經(jīng)生長相關蛋白(growth associated protein-43,GAP-43)的蛋白水平與mRNA水平表達的影響,深入探討左右歸丸治療EAE的可能機制,并比較兩方藥作用的異同,為臨床中醫(yī)藥辨證論治MS及其相關神經(jīng)退行性病變提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 225只SPF級雌性 Lewis大鼠,體重150 g～180 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,許可證號為SCXK(京)2006-0009。

1.2 藥品及試劑 醋酸潑尼松片:天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn);左歸丸與右歸丸:河南省皖西制藥股份有限公司生產(chǎn);豚鼠MBP68-86(YGSLPQKSQRSQDENPV):北京中科亞光生物科技有限公司合成;不完全福氏佐劑(Incomplete Freund’s Adjuvant,IFA)和結核分枝桿菌病(Mycobacterium Tubercusis,H37Ra,MTB):美國Difco公司生產(chǎn);APP、GAP-43和 GAPDH抗體:美國 Epitomics公司生產(chǎn);Western-blot試劑盒:北京康為世紀生物技術有限公司提供;實時熒光定量RT-PCR相關試劑:美國 Takara及Invitrogen公司提供;引物由上海生工生物有限公司合成;Fermentas K1622 RT逆轉錄試劑盒購自MBI公司;SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自美國應用生物公司。

1.3 模型制備 將大鼠隨機分為正常組、模型組、激素組、左歸丸組和右歸丸組。每組45只。模型組和各治療組按下述方法制作EAE模型,用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,兩后足墊多點一次性注射 200μL抗原(含50μg MBP68-86、100μL IFA及2 mg MTB)免疫,誘導大鼠產(chǎn)生 EAE。正常組只注射等量生理鹽水。

1.4 處理方法 左歸丸組和右歸丸組在大鼠造模后給予左歸丸(2 g/kg)和右歸丸(3 g/kg)灌胃,正常組、模型組、激素組(發(fā)病前)灌服相應劑量的生理鹽水,激素組(發(fā)病后)給予醋酸潑尼松(0.006 g/kg)。各組均為1次/日,共28 d。分別在免疫后第7天(疾病初期)、第14天(急性期)、第28天(緩解期)取大鼠腦白質與脊髓組織,每組各5只,進行APP和GAP-43蛋白和基因的檢測。其他動物另做其他指標的測定。

1.5 指標檢測

1.5.1 Western-blot檢測大鼠腦白質與脊髓中APP和GAP-43蛋白的表達 蛋白提取、定量及制備蛋白上樣樣品均按試劑盒說明書操作。進行SDS-PAGE電泳,90V通過濃縮膠,120 V通過分離膠,300 mA轉膜80 min,立春紅染色,5%脫脂奶粉搖床封閉1 h,加 APP(1∶10 000)、GAPDH(1∶8 000)、GAP-43(1∶10 000)抗體,4℃過夜,洗膜 5 min×4次,入山羊抗兔 IgG(1∶12 000),室溫搖床孵育1 h,洗膜 5 min×6次,ECL孵育 5 min后,暗室膠片曝光,顯影,定影。YLN-2 000凝膠影像分析系統(tǒng)掃描照片,Image J處理圖片,Image Quant TL讀取條帶的積分光密度值,半定量分析各組蛋白表達。

1.5.2 實時熒光定量RT-PCR法檢測大鼠腦白質與脊髓中APP和GAP-43m RNA的表達 RNA的提取和cDNA的合成均按試劑盒說明書操作,PCR引物序列見表1。PCR總體系12 μL,其組成為 RNA樣品量2μg,OligoDT 1μL,DEPC水補至12μL。Real Time反應體系為:REAL SYBRMixture(2×)10μL,上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各0.5μL,模板1.5μL,加入DEPC水量至20μL。反應條件為APP:95℃預變性5 min,95℃變性35 s,54℃退火35 s,每兩個循環(huán)降1℃,72℃延伸60 s,循環(huán)40次,反應結束后,72℃延伸8 min,4℃保存。GAP-43和GAPDH:95℃預變性5 min,94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸90 s,循環(huán)40次。反應結束后,72℃延伸10 min,4℃保存。實驗數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)采用△△Ct分析法。

表1 各項檢測指標引物序列

2 結 果

2.1 各組大鼠腦白質和脊髓中APP的表達(見表2) 在腦白質中,免疫后第7天,其他各組EAE大鼠APP表達顯著高于正常組(P＜0.01),組間比較,差異無統(tǒng)計學意義;第 14天,模型組APP表達明顯高于正常組(P＜0.05),各治療組APP表達較模型組有所降低,但差異無統(tǒng)計學意義;第28天,各組EAE大鼠APP表達顯著低于正常組(P＜0.01),且激素組APP水平低于模型組(P＜0.05)。在脊髓中,免疫后第7天,模型組大鼠APP表達顯著低于正常組(P＜0.01),激素組與左歸丸組顯著提高 APP表達(P＜0.01),且作用優(yōu)于右歸丸組(P＜0.05);第14天、28天,各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。

表2 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間APP的變化( ±s)

表2 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間APP的變化( ±s)

組別 劑量g/kg第7天腦白質 脊髓第14天腦白質 脊髓第28天腦白質 脊髓正常組 - 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00模型組 - 1.56±0.352) 0.48±0.132) 1.32±0.221) 1.13±0.30 0.40±0.112) 1.23±0.52激素組 0.006 1.67±0.322) 1.45±0.504)5) 1.14±0.22 1.19±0.34 0.22±0.092)3) 1.07±0.30左歸丸組 2 1.69±0.722) 1.34±0.424)5) 1.01±0.18 0.98±0.27 0.24±0.152) 1.38±0.48右歸丸組 3 1.83±0.722) 0.60±0.43 1.01±0.23 0.91±0.19 0.32±0.152) 0.95±0.33與正常組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與右歸丸組比較,5)P＜0.05

2.2 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間APP mRNA的變化(見表3) 在腦白質中,免疫后第7天,模型組大鼠APPmRNA表達顯著低于正常組(P＜0.01),各治療組APP mRNA表達均高于模型組(P＜0.05或P＜0.01);第14天,模型組APPmRNA水平明顯高于正常組(P＜0.05),激素組和左歸丸組APP m RNA表達均明顯低于模型組(P＜0.05),且左歸丸組APP mRNA表達低于右歸丸組(P＜0.05);第28天,模型組APP mRNA顯著高于正常組(P＜0.05),左歸丸組與右歸丸組APP mRNA水平接近正常水平。在脊髓中,免疫后第14天,模型組APP m RNA表達顯著低于正常組(P＜0.01),左歸丸組APP mRNA表達顯著高于模型組和右歸丸組(P＜0.05或P＜0.01)。

表3 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間APP m RNA的變化( ±s)

表3 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間APP m RNA的變化( ±s)

組別 劑量g/kg第7天腦白質 脊髓第14天腦白質 脊髓第28天腦白質 脊髓正常組 - 1.03±0.27 1.06±0.30 1.03±0.27 1.06±0.30 1.03±0.27 1.06±0.30模型組 - 0.44±0.322) 1.80±2.01 1.42±0.321) 0.75±0.212) 1.50±0.561) 1.24±0.38激素組 0.006 2.98±1.443) 0.76±0.99 1.03±0.123) 1.00±0.23 1.59±0.55 0.69±0.23左歸丸組 2 2.28±0.924) 1.20±0.84 0.97±0.073)5) 1.34±0.414)5) 1.37±0.71 1.10±0.62右歸丸組 3 3.24±2.133) 0.50±0.29 1.33±0.29 0.95±0.30 1.29±0.20 1.21±0.35與正常組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與右歸丸組比較,5)P＜0.05

2.3 各組大鼠腦白質和脊髓中GAP-43的表達(見表4) 免疫后第7天,在腦白質中,模型組GAP-43表達降低(P＜0.05),各治療組均能升高GAP-43表達水平,激素組與左歸丸組作用最為明顯(P＜0.05);第14天,模型組GAP-43表達顯著高于正常組(P＜0.01),激素組與左歸丸組能顯著抑制GAP-43的過高表達(P＜0.05);第28天,模型組GAP-43水平均低于正常組(P＜0.05),激素組與左歸丸組GAP-43水平顯著低于模型組(P＜0.01),且顯著低于右歸丸組(P＜0.01)。在脊髓中,免疫后第7天,模型組GAP-43水平顯著降低(P＜0.01),激素組與左歸丸組GAP-43表達水平顯著高于模型組與右歸丸組(P＜0.05或 P＜0.01);第28天,模型組、激素組和右歸丸組GAP-43表達均顯著低于正常組(P＜0.01),左歸丸組GAP-43表達水平與正常組比較無統(tǒng)計學意義。

表4 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間GAP-43的變化( ±s)

表4 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間GAP-43的變化( ±s)

組別 劑量g/kg第7天腦白質 脊髓第14天腦白質 脊髓第28天腦白質 脊髓正常組 - 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00模型組 - 0.77±0.131) 0.51±0.072) 1.39±0.282) 1.06±0.32 0.79±0.151) 0.91±0.052)激素組 0.006 0.91±0.123) 1.78±0.734)5) 1.01±0.093) 1.15±0.23 0.36±0.182)4)5) 0.84±0.082)左歸丸組 2 1.03±0.323) 1.75±1.103)5) 1.09±0.223) 1.17±0.43 0.38±0.142)4)5) 0.97±0.23右歸丸組 3 0.83±0.23 0.35±0.06 1.20±0.26 1.11±0.20 0.63±0.122) 0.79±0.172)與正常組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與右歸丸組比較,5)P＜0.01

2.4 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間GAP-43 mRNA的變化(見表5) 在腦白質中,免疫后第 7天,模型組與激素組GAP-43 mRNA水平較正常組顯著升高(P＜0.05或P＜0.01),右歸丸組GAP-43 mRNA表達水平顯著低于模型組(P＜0.05);第14天,模型組GAP-43 m RNA表達顯著低于正常組(P＜0.05);第28天,各組 GAP-43 mRNA水平無明顯變化。在脊髓中,各組在不同時間點GAP-43 mRNA水平無顯著性的變化。

表5 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間GAP-43 m RNA的變化( ±s)

表5 各組大鼠腦白質和脊髓中不同時間GAP-43 m RNA的變化( ±s)

組別 劑量g/kg第7天腦白質 脊髓第14天腦白質 脊髓第28天腦白質 脊髓正常組 - 1.17±0.68 1.09±0.47 1.17±0.68 1.09±0.47 1.17±0.68 1.09±0.47模型組 - 2.07±0.621) 1.54±1.14 0.72±0.221) 0.94±0.19 0.86±0.41 1.33±0.18激素組 0.006 2.39±0.982) 1.14±1.57 0.65±0.25 0.88±0.38 1.05±0.29 1.04±0.09左歸丸組 2 1.51±1.12 1.39±1.31 0.60±0.30 0.92±0.23 1.29±0.49 1.23±0.43右歸丸組 3 0.88±0.233) 0.89±0.86 0.90±0.29 0.87±0.13 1.09±0.36 1.06±0.20與正常組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與模型組比較,3)P＜0.05

3 討 論

MS及EAE在疾病早期就有廣泛的軸突損害,持續(xù)性軸突的損傷導致了不可逆性神經(jīng)功能障礙[7],現(xiàn)有的各種治療手段僅能起到延緩而不能阻止其發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥能改善MS患者神經(jīng)癥狀,調(diào)節(jié)免疫功能,減少復發(fā)率,彌補西醫(yī)治療的不足[8]。中醫(yī)學認為本病與“痿證”中的“骨痿”極為相似,病位在腦髓,腎虛是MS的根本病機。周莉等[9]發(fā)現(xiàn)MS早期或急性期以肝腎陰虛為主,晚期或晚發(fā)型MS以脾腎陽虛或陰陽兩虛為主。因此補腎為治病大法,滋陰可選用左歸丸,溫陽可選右歸丸[10],二方均有益髓填精之功。現(xiàn)代藥理研究表明左右歸丸對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用,且左歸丸能促進骨髓再生[11]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn),二方對EAE大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、GAP-43和軸突生長抑制因子NogoA等均具有調(diào)節(jié)作用,有利于神經(jīng)再生[5,6]。本實驗重點觀察左歸丸和右歸丸對EAE大鼠APP與GAP-43蛋白與基因表達的作用,探討左歸丸和右歸丸對EAE保護的可能機制及比較兩方藥作用的異同。

APP是軸突損傷后的一種快速反應性蛋白[12],并以前體蛋白及多種裂解產(chǎn)物的形式在神經(jīng)組織損傷、修復中發(fā)揮重要作用[13]。研究發(fā)現(xiàn),EAE小鼠在發(fā)病急性期大腦APP強陽性表達[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),EAE大鼠在免疫后第14天腦白質中APP表達升高,第28天表達下降且低于正常水平[15]。本次研究發(fā)現(xiàn),APP和APPmRNA在EAE大鼠腦白質和脊髓中呈動態(tài)變化,且蛋白和基因的表達不同步。APP表達升高可能與炎癥產(chǎn)生的白細胞介素-1刺激 APP蛋白表達增多有關[16],或是由于軸突損傷后軸漿中APP運輸中斷導致其堆積。APP蛋白表達降低可能與細胞膜構象的改變有關[15]。經(jīng)藥物治療后,激素與左歸丸均對升高或降低的APP和APP m RNA具有一定的調(diào)節(jié)作用,且左歸丸對其的調(diào)節(jié)作用明顯優(yōu)于右歸丸。由于APP的生理功能很復雜,APP的過高或過低表達對機體可能是不利的,目前對APP在不同類型及不同損傷程度的神經(jīng)損傷模型中的研究報道還較少,左右歸丸對其調(diào)節(jié)的機制還有待深入探討。

GAP-43在神經(jīng)元發(fā)育和軸突生長時高水平表達[17],神經(jīng)元損傷后,其周圍的神經(jīng)元可通過側支發(fā)芽和反應性軸突再生進行功能代償,這些區(qū)域GAP-43水平表達再次升高[18,19],當軸突到達相應的靶組織時,突觸重塑完成,GAP-43水平迅速降低,乃至消失,軸突生長停止[20]。有報道稱GAP-43 m RNA在EAE小鼠脊髓中高表達[21]。GAP-43的表達與GAP-43 mRNA的表達存在不同步性[22]。本實驗也發(fā)現(xiàn)GAP-43 m RNA在疾病初期明顯升高,GAP-43的升高滯后于GAP-43 mRNA。GAP-43 mRNA的過高表達可導致細胞凋亡[23],而發(fā)生細胞凋亡的區(qū)域神經(jīng)元中GAP-43水平顯著降低[24]。本實驗發(fā)現(xiàn),EAE模型大鼠腦白質和脊髓中GAP-43在疾病初期表達降低,急性期升高,緩解期又有所下降,而腦白質中GAP-43 mRNA的表達在疾病初期升高,急性期降低。治療組對GAP-43和GAP-43 m RNA的表達具有一定的調(diào)節(jié)作用。激素與左歸丸能顯著調(diào)節(jié)腦白質和脊髓中GAP-43的過低或過高表達。緩解期GAP-43水平的快速回落,提示激素與左歸丸治療有利于損傷后軸突再生修復,縮短突觸重塑時間。右歸丸能明顯抑制疾病初期腦白質中GAP-43 mRNA的過高表達。以上結果表明,激素、左歸丸和右歸丸均能在不同時間點對GAP-43和GAP-43 m RNA的表達具有一定調(diào)節(jié)作用,但調(diào)節(jié)靶點存在差異,左歸丸在調(diào)節(jié)GAP-43表達方面作用明顯優(yōu)于右歸丸。可能與二方中所含滋陰藥與溫陽藥的比例不同有關。右歸丸對EAE的防治機制可能通過其他途徑實現(xiàn)的。今后還需要深入研究其促進軸突再生的信號轉導通路,為臨床運用滋陰補腎或溫陽補腎法治療MS提供科學內(nèi)涵。

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