顆粒顯色指示技術快速檢測結核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥性的價值

王冬敏 林健雄 彭東東 李進展 李耿聰 李鴻檳 陳蕊明

吡嗪酰胺是一種重要的一線抗癆藥物，由于其可殺滅酸性巨噬細胞內的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）和半休眠菌，可使結核病的復發率大大下降，在現代結核病控制策略中廣泛應用于短程化療方案，幾乎100%的新發結核病患者開始治療時都使用吡嗪酰胺，因此耐吡嗪酰胺的Mtb也越來越多，據文獻［1]統計為5.8%～18.6%，特別是近年來吡嗪酰胺的耐藥率明顯上升，甚至有些國家和地區報道的吡嗪酰胺耐藥率高達50.9%［2]。藥物敏感度試驗是實驗室指導臨床第一線科學用藥的重要手段之一。大多數藥敏試驗都可以在pH中性的常規培養基上順利進行，但吡嗪酰胺藥敏試驗例外，由于吡嗪酰胺僅在pH為5.5的酸性條件下才能轉化為殺菌的吡嗪酸，而Mtb在酸性條件下生長很差，甚至不生長，從而導致吡嗪酰胺的敏感試驗一直是實驗室中的一個難題。過去吡嗪酰胺的敏感試驗一直沿用酸羅氏法，但由于羅氏培養基中所含蛋白質對藥物有吸附作用，且在酸性條件下，Mtb生長緩慢，甚至不生長，從而使酸羅氏法耗時長，需3～4周，而且結果不夠穩定，可靠性差，已不能完全適應臨床快速敏感試驗的要求［3－4]，因而目前我國的大多數結核病實驗室沒有常規開展吡嗪酰胺的藥敏試驗。國外經濟發達國家通常使用BACTEC MGIT－960、BacT／ALERT 3D 儀器的快速培養方法，但成本昂貴，制約了其推廣應用。為了更好地指導臨床對吡嗪酰胺的使用，有必要研究開發一種準確、快速、廉價的吡嗪酰胺藥敏試驗方法，以解決這一長期困擾臨床治療的難題。本研究應用顆粒顯色指示法測定102株Mtb的吡嗪酰胺耐藥性，并與BACTEC MGIT－960法結果進行比較，現將結果報道如下。

材料和方法

一、材料

1.待測菌株：102株 Mtb臨床分離株均選自汕頭市結核病防治所2011年3—5月結核病患者的標本BACTEC MGIT－960初培養陽性菌株，經抗酸染色確認為抗酸桿菌，并經常規生化反應鑒定為Mtb。

2.細菌生長指示管（bacterial growth indicator tube，BGIT）：含0.075g氧化還原指示顆粒，用于指示微生物的繁殖（專利申請號：201010242710.7），批號：20101026；通用增菌培養基：含有 Middlebrook7H9營養肉湯、牛血清白蛋白、觸酶、多肽等特殊營養成分（注冊號：滬食藥監（準）2011第1400182號），為滿足吡嗪酰胺藥敏試驗要求，通用增菌培養基的pH已調整至最佳（pH 6.0～6.1之間），批號：20101012；吡嗪酰胺藥物：含量為2000μg／ml；由上海積彩醫療器械有限公司提供。

3.BACTEC MGIT－960吡嗪酰胺藥敏專用分枝桿菌生長指示管、藥敏試劑及960系統，由美國BD公司提供。

二、方法

對以上待測菌株同步進行顆粒指示顯色法和BACTEC MGIT－960法吡嗪酰胺藥敏實驗，操作均在Ⅱ級生物安全柜中進行。

1.顆粒指示顯色法：（1）取2支細菌生長指示管，在標簽處標記標本號，其中1支標注為1／10參照，另1支標注為藥敏管。（2）取1管4.9ml通用增菌培養基，用吸槍各精確吸取2ml培養液加入到細菌生長指示管中，余下含0.9ml培養液的管標注為稀釋管。（3）吸0.1ml吡嗪酰胺藥物加入藥敏管，使藥敏管中藥物的最終濃度為100μg／ml。（4）菌液標本取自BACTEC MGIT－960儀器提示陽性不超過24h的培養管，用吸槍反復吹打均勻后，吸取0.1ml菌液加入稀釋管，經充分混勻后吸0.1ml稀釋液加入1／10參照管；吸0.1ml原菌液加入藥敏管。（5）接種后置37℃培養，每天取出觀察生長指示管。當參照管出現紫色顆粒時判斷結果，藥敏管無紫色顆粒或紫色顆粒少于對照管判定為敏感，藥敏管中紫色顆粒多于或等同于參照管時判定為耐藥。結果判定方法見圖1。

圖1 吡嗪酰胺的藥敏試驗結果判定示意圖

2.BACTEC MGIT－960法吡嗪酰胺藥敏實驗按BACTEC MGIT－960操作手冊進行，由儀器讀取報告結果。

三、統計學分析

統計結果用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量數據以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為有統計學意義。

結 果

一、顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測吡嗪酰胺藥敏結果比較（表1）

兩種方法檢測結果均為敏感67株，均為耐藥30株，總符合率為95.1%（97／102）。5株菌株兩種方法檢測結果不符，其中3株顆粒顯色指示法測定為敏感，BACTEC MGIT－960法測定為耐藥；2株為顆粒顯色指示法耐藥，BACTEC MGIT－960法檢測為敏感。如以BACTEC MGIT－960法測定吡嗪酰胺耐藥性結果為考核標準，則顆粒顯色指示法檢測吡嗪酰胺耐藥性的敏感度為90.9%（30／33），特異度 為 97.1% （67／69），陽 性 預 測 值 為 93.8%（30／32），陰性預測值為95.7%（67／70），準確性為95.1%（97／102）。

二、顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測吡嗪酰胺藥敏報告時間比較

結果顯示顆粒顯色指示法出現陽性結果的最早時間是7d，最晚時間為14d，平均（9.47±1.66）d；BACTEC MGIT－960法出現陽性結果的最早時間是6d，最晚時間為13d，平均（9.33±1.77）d，兩者差異無統計學意義（t＝0.573，P＞0.05）。詳見表2。

表1 顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測吡嗪酰胺藥敏結果比較（株）

表2 顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測吡嗪酰胺藥敏報告時間比較

討 論

吡嗪酰胺是治療結核病最有效的一線藥物中的重要藥物，該藥物于1940年由Hall等在合成氨基吡啶過程中作為一種中間化合物首次被合成［5]，它的抗結核菌活性于1952年被Yeager等發現。但其與利福平和異煙肼聯用治療結核病顯著縮短化療時間的獨特作用是在其用于治療結核病29年之后的1981年才見報道［6]。吡嗪酰胺用于治療結核病至今已有半個世紀，其抗菌機制為：吡嗪酰胺是一種煙酰胺類似物，與異煙肼相似也是一種抗Mtb的原藥，但其發揮作用所要求的環境不同，吡嗪酰胺需要在酸性環境才表現抗菌活性且最低抑菌濃度（MIC）與pH值在7.0以下存在很好的正相關性［7]。吡嗪酰胺通過被動擴散進入Mtb細胞內，在Mtb細胞內由吡嗪酰胺酶（PZase）將其轉化為具有抗Mtb活性形式的吡嗪酸，所以PZase活性對吡嗪酰胺表現抗Mtb活性是必需的，眾多的研究結果支持pncA基因的突變造成PZase活性降低或喪失是Mtb產生對吡嗪酰胺耐藥的主要原因，隨著研究的深入，亦有很多研究結果表明，并不是所有耐藥菌株都存在pncA基因突變，大約70%的吡嗪酰胺耐藥菌株存在pncA基因突變，而且pncA基因存在突變但PZase還保持活性，因而目前通過基因檢測的手段檢測吡嗪酰胺耐藥性的方法尚未成熟［8]。

目前，檢測吡嗪酰胺耐藥性的方法主要有用羅氏培養基的絕對濃度法藥敏試驗、快速培養儀檢測法和分子生物學檢測技術。由于吡嗪酰胺在體外酸性環境中才能表現出抗菌活性，而Mtb在酸性環境下生長不良，使得常規方法測定吡嗪酰胺的耐藥性存在一定困難，而且耗時長、準確性差。從而導致吡嗪酰胺的敏感試驗一直是實驗室中的一個難題，中國防癆協會2009年出版的《結核診斷實驗室檢驗規程》里亦沒有頒布吡嗪酰胺的藥敏試驗方法。分子生物學檢測技術快速，但操作繁瑣，且突變檢出率偏低，pncA基因檢測法在3種方法中最快速，可彌補常規藥敏試驗的不足，但國內王金河等［4]的研究報道與酸羅氏法的符合率為75%，符合70%左右的吡嗪酰胺耐藥株存在pncA基因突變這一耐藥分子機制，但仍有30%左右的菌株不能用此方法正確地鑒定出。BACTEC MGIT－960快速培養儀具有美國FDA認證的一線抗結核藥物藥敏試驗，在發達國家通常作為標準方法，但其吡嗪酰胺耐藥性測定需要專用的培養基和配套試劑，費用特別昂貴，價格幾乎相當于其他4種一線藥物的總和，限制了它的推廣應用。因此，快速、簡便、靈敏的吡嗪酰胺耐藥性測定技術研究是國內外學者所關注的課題，為了更好的指導臨床對吡嗪酰胺的使用，有必要研究開發一種準確、快速、廉價的吡嗪酰胺藥敏試驗方法。國內匡鐵吉教授在20世紀80年代研制的匡氏瓊脂培養基吡嗪酰胺藥敏試驗，能在3周左右報告結果，與酸羅氏法符合率為100%［4]；上海市結核重點實驗室研究了吡嗪酰胺耐藥性Mtb的噬菌體檢測技術，可以在3d內報告結果，與酸羅氏法比較準確性達到91.7［9]，因對比方法的不同，本研究未與上述方法進行比較。

建立Mtb的吡嗪酰胺耐藥性的方法，必須解決2個關鍵問題，一是吡嗪酰胺作用所需的酸性環境與Mtb在酸性環境下生長不良的問題，二是如何快速簡便指示細菌生長。本研究使用的手工操作的顆粒顯色指示液體培養系統，通用液體培養基含有營養豐富Middlebrook7H9營養肉湯和牛血清白蛋白、觸酶、多肽等特殊營養成分，并且使用0.1mol的鹽酸調節pH至6.0～6.1之間，可以很好地解決Mtb生長和吡嗪酰胺作用的問題。細菌生長指示管（BGIT），采用新型的氧化還原反應顯色指示劑，當有活的Mtb存在，則顆粒還原為紫紅色，顯色快，長時間保持顏色穩定不變，大大提高了結果的可靠性，具有簡便、快速、準確的優點，可為臨床及時提供結果。本研究中顆粒顯色指示法最早報告結果的時間比BACTEC MGIT－960法稍晚一天左右，主要集中在第8、9、10天出結果，二者的生長速度經統計學分析差異無統計學意義，而且其耗材成本略高于酸羅氏法而遠遠低于BACTEC MGIT－960法。總之，本研究利用顆粒顯色指示法檢測Mtb臨床分離株對吡嗪酰胺的耐藥性，跟BACTEC MGIT－960法比較，有較高的敏感度和特異度，結果報告時間差異無統計學意義，是一種快速、敏感、操作簡便，與標準方法符合率高的藥敏試驗方法。鑒于實驗例數較少，筆者期盼著通過不同研究者的反復論證和不同實驗室的反復試驗，最終能為吡嗪酰胺的耐藥性提供一種快速檢測手段。

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