干擾素體外釋放酶聯免疫法在結核病診斷中的價值

劉佳文 康麗軍 翁繩鳳 朱新穎

目前我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病人數的14.3%，位居世界第2位，結核分枝桿菌感染率高，人感染結核分枝桿菌后，大部分會成為無癥狀的潛伏性結核感染者（latent tuberculosis infection，LTBI）。然而當機體免疫力降低時，則會導致結核分枝桿菌大量增殖，引發臨床疾病。盡早發現結核分枝桿菌感染是預防與控制結核病傳播的重要手段之一。北京萬泰生物藥業股份有限公司研制的結核分枝桿菌相關γ－干擾素檢測試劑盒（體外釋放酶聯免疫法）（Wantai quantitative diagnostic kit for Mycobacterium tuberculosis IFN－γrelease assay，WT－IGRA）（簡稱 WT 試劑）與澳大利亞Cellestis有限公司生產的QuantiFERON·－TB試劑盒 （QuantiFERON·－TB GOLD in tube，QFTGIT）（簡稱QFT試劑）的檢測原理一致，均是檢測結核特異性抗原介導的細胞免疫反應。抗原ESAT－6、CFP－10和 TB7.7為致病性結核分枝桿菌特有，而卡介苗沒有的片段［1]。LTBI體內擁有針對這些抗原的特異性T淋巴細胞，能識別、遞呈這些抗原，并刺激T淋巴細胞增殖、釋放細胞因子，如γ－干擾素［1]（IFN－γ）。而 QFT 試劑和 WT 試劑可以定量檢測這些釋放的特異性IFN－γ。為各級醫療單位的結核分枝桿菌感染診斷提供一種間接的檢測方法，為臨床醫生提供一種結核病尤其是肺外結核的輔助診斷方法。筆者用2種試劑檢測病區與門診結核病患者（249例）及健康者（140例）的全血標本，評價干擾素體外釋放酶聯免疫法（quantitative diagnostic kit for Mycobacterium tuberculosis IFN－γrelease assay，TB－IGRA）在結核病診斷中的應用價值。

對象和方法

一、對象

249例結核病患者來自2010年10月12月北京老年醫院感染門診和感染病房；其中男性159例，女性90例，平均年齡44歲；痰菌陽性肺結核（痰抗酸桿菌涂片陽性或培養陽性）58例，痰菌陰性肺結核（痰抗酸桿菌涂片及培養均陰性）95例，痰菌陰性肺外結核（痰抗酸桿菌涂片及培養均陰性）14例，實驗室結果不全結核病患者82例（無痰抗酸桿菌涂片及培養結果）；菌陰肺結核的診斷主要是根據臨床癥狀及影像檢查并參照菌陰肺結核的診斷標準排除其他疾病后確診為痰菌陰性肺結核［2]。普通人群140例，其中28例為北京老年醫院檢驗科工作人員或其家屬［其中LTBI人群（PPD 3＋～4＋）11例] ，男性64例，女性76例，平均年齡31歲；LTBI［無結核癥狀，但結核菌素試驗（PPD）結果≥20mm，包括出現水泡的人群] 20例；正常對照（明確為非結核病患者，且PPD＜3＋，無水泡的普通人群）120例。

二、儀器和試劑

Mutiskan MK3型酶聯免疫檢測儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司生產。WT試劑與QFT試劑。

三、方法（按說明書方法進行）

1.WT試劑試驗步驟：首先，使用BD（美國BD公司）肝素鋰抗凝采血管抽取超過5ml靜脈血，馬上輕柔地顛倒混勻3次以上，使抗凝劑充分溶解。采集到全血分裝到3種不同的培養管中。“T”為添加了結核特異性抗原ESAT－6、CFP－10的測試培養管；“N”為本底對照培養管；“P”為添加了非特異刺激抗原植物血球凝集素（PHA）的陽性對照培養管。每種培養管分裝1ml，分裝前需要顛倒混勻3次以上。分裝后輕柔顛倒培養管5次，立刻于37℃培養箱中靜置培養（22±2）h。靜置培養（22±2）h后取出，離心收集上清液。其次，用雙抗體夾心法定量檢測上清液中IFN－γ的含量。根據刺激培養系統中特異性升高的IFN－γ的量，來判定是否為結核分枝桿菌感染陽性。理論上每位受試者都能對非特異刺激抗原PHA產生反應。

2.QFT試劑試驗步驟：QFT試劑新鮮全血標本采集，利用參考試劑中提供的3種不同的采血管，按照本底對照培養管、結核特異性抗原測試培養管、非特異刺激抗原陽性對照培養管的順序分別采集1ml靜脈血，馬上輕柔的顛倒搖勻3次以上，使抗凝劑充分溶解。新鮮全血經刺激培養（22±2）h后，（1080～3130）×g離心10min，取上清液放于新的環氧樹脂（EP）管中，完成酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測。

四、統計學處理

應用SPSS 11.5統計軟件進行數據統計處理，計數資料組間比較，采用χ2檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、TB－IGRA檢出結核分枝桿菌感染的陽性率和特異度

結核患者249例，正常對照120例，LTBI 20例，檢測結果見表1。140例普通人群中，28例為北京老年醫院檢驗科的工作人員或其家屬，WT試劑陽性率 46.4%（13／28），QFT試劑陽性率67.8%（19／28），PPD 3＋～4＋率為39.3%（11／28）。WT試劑特異度、QFT試劑特異度均為83.3%（100／120）。

表1 結核組與正常對照組的WT試劑和QFT試劑TB－IGRA結果

表2 痰菌陽性組與痰菌陰性組WT試劑和QFT試劑TB－IGRA結果

二、菌陽和菌陰結核病患者WT試劑和QFT試劑陽性率比較

無痰抗酸桿菌涂片及培養結果的82例結核病患者未進行統計。痰菌陰性結核病患者WT試劑陽性率為76.1%［（71＋12）／（95＋14）] ，痰菌陰性結核病患者 QFT試劑陽性率65.1%［（61＋10）／（95＋14）] （表2）。痰菌陽性組與痰菌陰性組比較，WT試劑χ2＝0.082，P＞0.05；QFT 試劑χ2＝0.075，P＞0.05，差異均無統計學意義。痰菌陰性肺結核組與痰菌陰性肺外結核組比較，WT試劑χ2＝0.081，P＞0.05；QFT 試劑χ2＝0.280，P＞0.05，差異均無統計學意義。

三、PPD結果與TB－IGRA結果之間的相關性

PPD與WT試劑、QFT試劑的相關性，由強到弱，呈明顯遞減趨勢；PPD檢測結果為3＋～4＋，WT試劑的檢出陽性率77.9%（67／86），QFT試劑的檢出陽性率68.6%（59／86）；PPD檢測結果為陰性，WT試劑的檢出陽性率43.5%（10／23），QFT試劑的檢出陽性率30.4%（7／23）（表3）。

表3 WT試劑和QFT試劑TB－IGRA結果與PPD相關性（例）

四、WT試劑與QFT試劑符合率

WT試劑與QFT試劑陽性符合率為91.9%［181／（181＋16＋0）×100%] ，陰性符合率為77.0%［147／（44＋147＋0）×100%] ，總符合率為84.3%［（181＋147＋0）／（197＋191＋1）×100%] （表4）。

討 論

目前常用的結核診斷方法有X線胸片、PPD試驗、抗酸染色、結核（TB）－聚合酶鏈反應（PCR）檢測等。傳統的抗酸桿菌染色及結核桿菌培養都因其敏感度、特異度及檢測速度等方面的問題而不能滿足臨床需要。近年來，針對結核桿菌特異性蛋白的TB－IGRA已普遍用于結核桿菌感染的診斷。TBIGRA的原理是檢測機體對結核桿菌特異性蛋白ESAT－6、CFP－10和 TB－7.7的免疫反應。與PPD試驗用的結核菌素不同，這些蛋白在所有結核分枝桿菌及致病性牛分枝桿菌中特異表達，而在卡介苗和大多數非結核分枝桿菌中不表達［1]。因此，TB－IGRA檢出結核桿菌感染的特異度和敏感度都較高。

表4 WT試劑和QFT試劑TB－IGRA結果符合率（例）

一、TB－IGRA檢出結核桿菌感染的特異度和敏感度

本試驗中，在249例結核患者中，WT試劑陽性率76.3%，QFT 試劑陽性率67.1%，WT 試劑和QFT試劑特異度都是83.3%，與國內使用相同試劑所做的試驗有差異。張華等［3]報道 WT試劑陽性率90.24%，特異度93.34%，李曉非等［4]報道WT試劑陽性率90.9%，特異度76.9%，分析其中的原因可能與標本量的大小、標本的來源有關。WT試劑盒于2010年在昆明市第三人民醫院、北京老年醫院、廈門市疾病預防控制中心同時使用，標本量擴大到786例，其中有637例陽性，陽性率為81.0%。本試驗檢測菌陽病區結核患者、菌陰肺外結核患者陽性檢出率較高，WT試劑分別為88.2%（15／17）、85.7%（12／14）。也和國外報道接近［5]。

二、菌陽和菌陰結核病患者WT試劑和QFT試劑陽性率比較

菌陽和菌陰結核病患者WT試劑陽性率分別為74.1% （43／58），76.1% （83／109），χ2＝0.082，P＞0.05，QFT試劑陽性率分別為67.2%（39／58），65.1%（71／109），χ2＝0.075，P＞0.05，菌陰肺結核與菌陰肺外結核患者WT試劑陽性率分別為74.7%（71／95），85.7%（12／14），χ2＝0.081，P＞0.05，QFT試劑陽性率分別為64.2%（61／95），71.4%（10／14），χ2＝0.280，P＞0.05，上述差異均無統計學意義。對于TB－IGRA可作為評估抗結核治療療效的理想指標［6]的結論還需進一步論證。

三、TB－IGRA檢測結核潛伏感染意義

由于目前缺乏檢測結核潛伏感染特異性的黃金標準，以無結核癥狀，但PPD結果3＋～4＋的人群定義為結核分枝桿菌潛伏感染［7]，從表1可以看到，QFT試劑 TB－IGRA 陽性率為60.0%（12／20）；北京老年醫院檢驗科28例工作人員和家屬中，PPD 3＋～4＋率為39.3%（11／28），QFT試劑TB－IGRA陽性率為67.8%（19／28），北京老年醫院檢驗科是結核病實驗室，有大量的含結核分枝桿菌的痰標本，其工作人員或多或少接觸結核分枝桿菌，均是結核分枝桿菌的密切接觸者。Brodie等［8]報道TB－IGRA值與結核患者的密切接觸程度相關，且不受機體免疫力及卡介苗接種的影響。此次研究發現，北京老年醫院檢驗科工作人員工作時間長短（密接程度）與TB－IGRA值大小無正比例關系，其中1例工作時間最長，但TB－IGRA為陰性。即使這樣，這項研究表明，TB－IGRA和PPD 2種檢測方法對結核潛伏感染的檢出都有一定的作用。當PPD檢測結果為3＋～4＋，WT試劑陽性檢出率為77.9%（67／86）。但 PPD 檢測可能增加其后 TBIGRA中對干擾素的應答水平。南非一項研究顯示，篩查結核潛伏感染可采用先PPD檢測后TBIGRA的二步策略，但TB－IGRA須在PPD檢測之后的3d內進行［9]。

四、WT試劑與QFT試劑符合率

這個研究采用2個廠商的試劑是為了更好評價TB－IGRA方法的真正價值。雖然原理相同，但2種試劑結果仍存在差別，389例中有61例結果不符（見表4）；總的來說，WT試劑與QFT試劑符合率良好，達84.3%。但TB－IGRA方法在中國要應用到臨床中還有很多工作需要做，特別是不同廠商試劑結果的可比性，方法學的標準化、規范化、臨界值（cut off值）合理性等還需要做進一步的研究。

［1] Mahairas GG，Sabo PJ，Hickey MJ，et al.Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M.bovis.Bacteriol，1996，178（5）：1274－1282.

［2] 中華醫學會.臨床診療手冊結核病分冊.北京：人民衛生出版社，2005：122.

［3] 張華，黃圣文，羅振元.結核分枝桿菌γ－干擾素體外釋放定量試驗診斷結核感染的臨床應用.中華醫院感染學雜志，2009，19（14）：1898－1899.

［4] 李曉非，趙琴，汪亞玲，等.兩種結核分枝桿菌γ－干擾素定量檢測試劑盒檢測結核分枝桿菌感染結果比較研究.中國防癆雜志，2011，33（5）：267－270.

［5] Diel R，Goletti D，Ferrara G，et al.Interferon－γrelease assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection：a systematic review and meta－analysis.Eur Respir J，2011，37（1）：88－99.

［6] 楊智峰，周霞.利用結核分枝桿菌抗原特異性γ－IFN體外釋放測定評估抗結核治療療效的臨床應用價值.氨基酸和生物資源，2009，31（1）：67－69.

［7] Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century：new tools to tackle an old enemy.Chest，2007，131（6）：1898－1906.

［8] Brodie D，Lederer DJ，Gallardo JS，et al.Use of an interferongamma release assay to diagnose latent tuberculosis infection in foreign－born patients.Chest，2008，133（4）：869－874.

［9] Richeldi L.Diagnosing latent tuberculosis infection：guess who’s coming to dinner？Am J Respir Crit Care Med，2009，180（1）：1－2.