清肝化瘀合劑中藥材的水提醇沉工藝優化＊

孫梁燕，許永軍

(浙江省慈溪市人民醫院藥劑科，浙江 寧波 315300)

清肝化瘀合劑中藥材的水提醇沉工藝優化＊

孫梁燕，許永軍

(浙江省慈溪市人民醫院藥劑科，浙江 寧波 315300)

目的 探討清肝化瘀合劑的水提醇沉工藝條件。方法 以芍藥苷的含量為指標，采用高效液相色譜法測定含量，用正交試驗方法對水提和醇沉進行工藝優化。結果 水提最佳工藝為A3B3C2D1，即取藥材飲片，加水10倍量，提取2次，每次2 h。醇沉最佳工藝為加質量分數為45%的乙醇，沉淀靜置48 h。結論 選擇芍藥苷含量為考察指標，能客觀反映出各工藝條件下的效果。所采用的高效液相色譜法具有操作簡便、分析準確、快速、干擾小等優點。

清肝化瘀合劑;芍藥苷;水提醇沉;高效液相色譜法

清肝化瘀合劑的處方來源于本院肝病科主任醫師治療非酒精性脂肪性肝炎并防治肝纖維化的驗方“清肝化瘀方”，由山楂、赤芍、白芍、絞股藍、丹參、川芎等組方，具清肝化瘀、活血理氣的作用[1－2]。處方中的赤芍、白芍具清熱涼血、柔肝、化瘀之功效，芍藥苷為兩藥的主要有效成分、且含量較高，故采用高效液相色譜(HPLC)法測定其含量作為考察指標。筆者依據正交試驗及平行試驗原理設計試驗方法[3]，對水提及醇沉除雜質的影響因素進行考察[4]，優選水提醇沉工藝的最佳方案。現報道如下。

1 儀器與試藥

HP－1100型高效液相色譜儀，包括G1322A脫氣機、G1311A四元泵、Rheodyne 7725i手動進樣閥、G1314A VWD紫外檢測器，Chemstation色譜工作站;TU－1810型紫外－可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);CQF－Ⅰ－6型超聲波清洗器(上海中船重工第七二六研究所);Delta 320型pH計(Mettler公司)。芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110736－200731);乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純;處方中所有藥材均購自浙江寶瑞醫藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 芍藥苷含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－0.8% 磷酸水溶液－水(16 ∶11 ∶73，V/V/V);流速:0.8 mL/min;檢測波長:230 nm;柱溫:25 ℃;進樣量:20 μL。

2.1.2 溶液制備

精密量取本品0.25 mL，置25 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，一次性濾器(0.45 μm)濾過，即得供試品溶液。取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得對照品溶液。取空白樣品(缺赤芍、白芍)0.25 mL，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

測定波長選擇:取芍藥苷對照品溶液，以紫外分光光度計于200～500 nm波長進行掃描。結果在230 nm波長處有最大吸收，參考文獻[5，7]，確定230 nm為本法的測定波長。

系統適用性及空白干擾試驗:取2.1.2項下3種溶液，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1)。結果，在此條件下芍藥苷對照品的出峰時間為10.117 min，供試品溶液中在與芍藥苷對照品相同保留時間出峰，并與其他組分達到分離，空白無干擾。理論板數按芍藥苷計算不低于10 000。

圖1 高效液相色譜圖

標準曲線制備:精密稱取芍藥苷適量，加60%甲醇溶解并定容，制成每1 mL含0.330 mg的對照品溶液。精密吸取上述溶液0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL，置 5 mL 量瓶中，以 60%甲醇定容，配成系列溶液。以峰面積積分值為縱坐標(Y)、質量濃度為橫坐標(X)繪制標準曲線，回歸方程為 Y=29.979 4X－40.244 4，r=0.999 9(n=5)。結果表明芍藥苷質量濃度在 16.5 ～82.5 μg/mL 范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

精密度試驗:精密配制低(39.6 mg/L)、中(49.5 mg/L)、高(59.4 mg/L)3種質量濃度的芍藥苷對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別在1 d內重復進樣5次，測得日內精密度 RSD分別為0.78% ，0.57% ，0.65%(n=5);再同法配制上述低、中、高 3 種質量濃度的對照品溶液，于5 d內重復進樣，測得日間精密度 RSD分別為 1.22% ，1.43% ，1.56%(n=5)。

重現性試驗:精密吸取6份樣品(批號為20091108)溶液，按2.1.2項下方法處理，進樣，計算芍藥苷的含量。結果分別為4.905，4.854，4.933，4.864，4.929，4.897 g/L，RSD=0.67%(n=6)，表明方法重現性良好。

穩定性試驗:取同一供試品(批號為20091108)溶液，分別于0，2，4，6，8 h時進樣，記錄峰面積積分值。結果芍藥苷峰面積分別為 1 432.257 93，1 416.856 57，1 440.693 36，1 420.873 66，1 437.437 87，RSD 為 1.45%(n=5)。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為20091115，5.477g/L)0.25 mL 共 9 份，分別加入對照品溶液(0.459 g/L)2.4，3.0，3.6 mL各3份，置50 mL量瓶中，按2.1.2項下方法進行處理后進樣，計算回收率。結果見表1。

表1 芍藥苷加樣回收試驗結果(n=9)

2.1.4 樣品含量測定

取樣品，依法處理并分析。

2.2 水提工藝條件優選

正交試驗設計:選擇提取時間(因素A)、加水量(因素B)、提取次數(因素C)、藥材粒度(因素D)為考察因素，以芍藥苷含量為指標，選定L9(34)正交表進行試驗。因素水平表見表2。按設計的工藝條件，以處方比例稱取藥材，水煎煮提取，合并提取液，2 500 r/min離心20 min，濾過，濾液濃縮至含生藥量為1 g/mL。

表2 因素水平表

水提工藝影響因素:根據正交試驗設計，測得不同條件下制備的清肝化瘀合劑中芍藥苷含量，見表3。方差分析見表4。由表3直觀分析表明，水提工藝的最佳工藝條件為A3B3C2D1，各因素影響順序為因素A＞B＞C＞D;由表4可見，因素D對水提工藝影響最小，故選擇D列作為誤差列。由表4可見，以芍藥苷含量為檢測指標所考察的4個因素中，因素A對提取工藝的影響有顯著性差異(P＜0.05)，最終確定最佳工藝為A3B3C2D1，即取藥材飲片，加水10倍量，提取2 h，分2次提取。

2.3 醇沉條件優選

2.3.1 平行試驗設計

為了除去雜質并最大限度的保留有效成分，減小服用劑量，在濃縮的水提液中加入適量乙醇以除去其中的淀粉、樹膠、多糖和蛋白質等雜質，選用平行試驗對影響醇沉的主要因素乙醇濃度、靜置時間，以芍藥苷為檢測指標進行考察。按上述優選的水提取工藝制備藥液，將其等分成6份，每份50 mL，按試驗設計進行醇沉，靜置后藥液抽濾，取上清液，沉淀用少量乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收至無醇味，加水調整至含生藥量1 g/mL。

表3 正交試驗結果表

2.3.2 乙醇質量分數篩選

將3份已制備好的藥液分別加入乙醇配制成不同的醇沉濃度，質量分數分別為40%，45%，50%，靜置相同的時間后抽濾藥液，取上清液，沉淀用少量乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收至無醇味，加水調整至含生藥量1 g/mL。結果質量分數分別為40%，45%，50%的乙醇芍藥苷轉化率分別為71.1%，76.5%，73.4%，表明乙醇質量分數為45%時轉化率最高。

2.3.3 靜置時間篩選

將3份已制備好的藥液加入乙醇配制成相同的醇沉濃度，分別靜置16，24，48 h后抽濾藥液，取上清液，沉淀用少量乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收至無醇味，加水調整至含生藥量 1 g/mL。結果靜置 16，24，48 h后芍藥苷轉化率分別為72.5%，73.8%和75.6%，表明靜置48 h時轉化率最高。

2.4 工藝驗證

按處方比例稱取山楂、赤芍、白芍等藥材，共3份，加水10倍量，提取2次，每次2 h;以45%乙醇沉淀，靜置48 h。中試制備3批樣品，芍藥苷含量為 4.897 ～5.477 g/L。

3 討論

清肝化瘀合劑原方湯劑服用有效[1－2]，且組方中含有水溶性活性成分，故確定了水提工藝。將優選的工藝條件經中試放大驗證，與小試基本吻合，且合劑中各藥材薄層層析斑點與原方湯劑完全一致，芍藥苷含量是原方湯劑的5.02倍。表明該工藝不僅穩定可行、重現性好，而且能保持原方湯劑中的化學成分基本不變，定量指標芍藥苷含量按制劑濃縮倍數提高，為全面評價該合劑與原方湯劑的等效性奠定了基礎。

芍藥苷含量測定采用高效液相色譜法，具有操作簡便、分析準確、快速、干擾小等優點。采用文獻報道的流動相如甲醇－乙腈－水(10∶10∶80)、甲醇－異丙醇－36%醋酸－水(25∶2∶2∶71)[5]、甲醇－0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液(40 ∶65)[6]、乙腈－水(13 ∶87)[7]等流動相作試驗，發現芍藥苷峰形均不理想，當選用乙腈－0.8%磷酸水溶液－水(16∶11∶73，V/V/V)為流動相且供試品以60%甲醇為溶劑時，獲得了滿意效果。

[1]張愛軍，袁國平，孫梁燕.清肝化瘀方治療非酒精性脂肪性肝炎120 例[J].浙江中醫雜志，2009，44(5):327.

[2]張愛軍，蘆亞君，陳曉蓉.清肝化瘀方抗非酒精性脂肪肝纖維化療效觀察[J].上海中醫藥雜志，2009，43(6):33.

[3]高鴻慈，陳華庭.實用藥學計算[M].北京:化學工業出版社，2007:267.

[5]張克榮，白 麗，徐贊美，等.RP－HPLC法同時測定白芍中芍藥苷和芍藥內酯苷的含量[J].藥物分析雜志，2003，23(3):222－224.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:147.

[7]張元震，耿 暉.降壓膠囊中芍藥苷的含量測定[J].中國藥師，2009，12(3):347.

Study on Technology of Water Extraction and Alcohol Precipitation of Chinese Medicinal Materials in Qingganhuayu Mixture

Sun Liangyan，Xu Yongjun
(Department of Pharmacy， Cixi Municipal People's Hospital， Ningbo， Zhejiang，China 315300)

Objective To optimize the technological conditions of water extraction and alcohol precipitation in Qingganhuayu Mixture.Methods The orthogonal test was adopted to optimize the technology of water extraction and alcohol precipitation.The paeoniflorin content was used as the assessment index and determined by HPLC.Results The optimum water extraction process was A3B3C2D1，i.e.，taking the medicinal materials as processed pieces，adding 10 times amount of water as extracting solvent，extracting twice and 2 h each time.The optimum alcohol precipitation process was as follows:the mass fraction was 45% ethanol，precipitating and static placing for 48 h.Conclusion The paeoniflorin content as the assessment index can reflect the effects of various technological conditions.The HPLC method has the advantages of simple operating，accurate analysis，rapidity and less interference.

Qingganhuayu Mixture;paeoniflorin;water extraction and alcohol precipitation;HPLC

TQ461;R286

A

1006－4931(2011)08－0049－03

2010－09－21)

＊浙江省慈溪市科技計劃項目，項目編號:CR200710。

孫梁燕(1969－)，女，副主任藥師，主要從事醫院藥學工作，(電子信箱)sly321123@163.com。