NET-1、EGFR在肺癌中的表達及意義

江蘇省鹽城市第一人民醫院（224001）卞偉鋼 胡平 宋曙 何嘯 王傳斌 陳萍

南通大學（226001）陳莉

NET-1(new EST tetraspan numbered 1)是由Serru等[1]于2000年在EST數據庫中發現的7個新的含四個跨膜區域蛋白超家族(TM4SF)的成員，是一個腫瘤增殖相關蛋白，在細胞信號轉導、調節、粘附、移動、增生和分化中起重要作用。已有報道，在多種惡性腫瘤中存在NET-1基因的異常表達[2～4]。表皮生長因子（EGFR）屬于表皮生長因子家族（erbB家族）成員之一[5]，其異常表達參與了腫瘤細胞的增殖、腫瘤血管生成、粘附、侵襲、轉移等過程。NET-1與EGFR在肺癌的發生、惡性進展中是否發生了協同作用，在國內外的研究中尚未見報道。

1 臨床資料

1.1 病例與標本 收集2004年1月～2006年12月鹽城市第一人民醫院、鹽城市腫瘤醫院、鹽城市第三人民醫院手術切除的肺癌組織標本120例。全部病例均行常規病理檢查，明確診斷與臨床分期。120例標本中，男性84例，女性36例，男、女比例為1:0.43；年齡34～78歲，中位年齡60歲，小于60歲的有51例，大于60歲的有69例。全部病例術前均未接受過化療及放療。取10例肺癌周邊相對正常的肺組織作為對照組，所有組織均用10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋，連續切片，作HE及免疫組化染色。

1.2 主要試劑 兔抗人多克隆抗體NET-1由南通大學醫學院病理教研室惠贈，美國舊金山基因生物公司協助合成，鼠抗人單克隆抗體EGFR、SP免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新生物技術公司。

1.3 免疫組織化學方法 常規脫蠟水化，組織抗原微波修復，10%山羊血清封閉。NET-1抗體的工作濃度為1:20，EGFR抗體的工作濃度為1:50，免疫組化染色SP法按說明書操作步驟進行，DAB-H2O2顯微鏡控制下顯色，蘇木精復染，常規脫水中性樹膠封片。使用PBS代替一抗處理的切片作為陰性對照，已知陽性組織切片作為陽性對照。

1.4 結果判斷 NET-1陽性染色定位于肺癌細胞的細胞質或細胞膜上，呈棕黃色顆粒，對陽性表達采用半定量積分法判斷，陽性細胞數<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度呈淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞百分比和染色強度兩項積分相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)[6]。EGFR的陽性染色定位于腫瘤細胞的胞質或胞膜上、個別位于胞核上呈棕黃色顆粒。光鏡下選擇5個表達EGFR相對較多的區域，在高倍鏡視野下每個視野分別計數200個細胞，共計1000個細胞，按陽性細胞數占腫瘤細胞的比例進行分級：陰性（-）為無棕黃色染色或染色陽性腫瘤細胞數<10%；弱陽性（+）為陽性細胞數 10%～<25%；中等陽性（++）為陽性細胞數 25%～<50%；強陽性（+++）為陽性細胞數≥50 %。

1.5 統計學處理 應用spss11.5英文版統計分析軟件對相關數據進行統計處理。率的比較采用x2檢驗和Fisher-exact檢驗，對影響生存預后的聯合效應采用 Cox比例風險模型進行多因素分析，納入的變量為性別、年齡、病變部位、臨床分期、病理分化程度、淋巴結轉移，采用Spearman等級相關分析兩指標間的關系。P<0.05有統計意義，所有檢驗和 P均為雙側。

2 結果

2.1 對照組與肺癌組NET-1、EGFR表達情況的比較 NET-1陽性表達于肺癌細胞的細胞質或胞膜上，EGFR陽性表達于肺癌細胞的細胞質或核膜上（附圖1～4）。120例肺癌中，NET-1、EGFR陽性率分別為85.00%（102/120）、69.16%（83/120）；對照組10例中陽性率分別為40.00%（4/10）、10.00%（1/10）。經統計學處理，肺癌組與對照組之間NET-1、EGFR的表達差異有統計學意義（χ2=13.0842，P=0.004；χ2=14.6362，P=0.002）。見附表1。

附表1 NET-1、EGFR在肺癌組與對照組中表達的比較

2.2 肺癌組織中NET-1、EGFR的表達與臨床病理因素的關系 肺癌組織中NET-1、EGFR的表達與腫瘤的臨床分期、分化程度及有無淋巴結轉移有關（P<0.05），而與患者性別、年齡、病變部位無顯著相關（P>0.05）。見附表2。

2.3 肺癌組織中NET-1、EGFR表達的關系筆者配對觀察了120例肺癌組織中NET-1、EGFR表達的情況，結果發現兩者同時為強陽性表達者20例，同時為陰性表達者11例，兩者的表達有相關性（χ2=51.8097，P=0.000），進一步做spearman等級相關分析，結果發現兩者在肺癌中的表達呈正相關（r=0.6107，P=0.000）。見附表3。

附表2 NET-1、EGFR的表達與肺癌臨床病理因素的關系

附表3 NET-1、EGFR在肺癌組織中表達的相互關系

3 討論

四聚體超家族（TM4SF）是一組含有4個疏水性跨膜結構域的蛋白，在細胞外形成兩個大小不等的環狀結構，氨基端和羧基端位于胞漿內。長度較短。這些分子之間有很多高度保守的序列，并且大多數同源性序列都位于跨膜區域[7]。從1990年發現至今，TM4SF的成員已發展到了25個，NET-1基因是TM4SF家族成員之一，定位于1p34.1，其mRNA全長為1297bp，編碼序列為128-853bp，有241個氨基酸的開放閱讀框[1]。陳莉等[8]通過RT-PCR技術篩檢人類48種組織與相應腫瘤，發現除造血系統組織與相應腫瘤、心、腦、胰不表達外，幾乎所有的人類組織及相應腫瘤均表達NET-1基因。本研究結果顯示，NET-1基因在肺癌組織與正常肺組織中表達的差異有統計學意義，且在臨床分期晚、分化程度低、有淋巴結組的表達水平顯著升高，提示NET-1作為一種胞質蛋白可能可以傳導細胞分裂的信息和/或引起細胞異向分化或去分化，它的過度表達與細胞增殖有關，可明顯上調肺癌的惡性進展過程。

附圖1 低分化腺癌NET-1高表達陽性定位于癌細胞質（SP×400）

附圖2 低分化鱗癌NET-1高表達陽性定位于癌細胞質（SP×400）

附圖3 低分化腺癌EGFR高表達陽性定位于癌細胞質與核（SP×400）

附圖4 高分化鱗癌EGFR高表達陽性定位于癌細胞質（SP×400）

EGFR是一個由原癌基因c-erbB-1編碼的相對分子質量為 170000的跨膜糖蛋白，是一種細胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，廣泛分布于除成熟骨骼肌細胞、體壁內胚層和造血組織以外的所有組織細胞。已有研究發現在多種腫瘤組織中存在EGFR的高表達[9][10]。本研究發現，肺癌組織中EGFR蛋白的表達較正常組織明顯升高，且在低分化、高分期有淋巴結轉移的病例中EGFR表達顯著高于高分化、低分期、無淋巴結轉移的病例，與文獻報道一致。由于酪氨酸激酶是細胞信號傳導的必要條件，因此，筆者認為在肺癌組織中EGFR與其配體結合后使得酪氨酸激酶磷酸化而激活酪氨酸激酶，通過催化與肌醇磷脂代謝有關的酶、激酶，調節蛋白磷酸化，促進產生第二信使，導致核內原癌基因c-myc、c-fos表達刺激肺癌細胞發生增殖，與肺癌的惡性進展密切相關。

盡管TM4SF蛋白的生物學功能不十分清楚，但有報道認為TM4SF與細胞粘附分子整合素的協同作用可特異性地調控后配體整合素依賴性信號轉導：影響粘附依賴性下游信號轉導事件，包括細胞蛋白的酪氨酸激酶的磷酸化和絲氨酸、蘇氨酸激酶PKB/c.Akt的激活，進而影響細胞的運動和分化。筆者對肺癌組織中NET-1與EGFR的表達進行了相關分析，結果提示兩者呈正相關，因此猜測在肺癌的發生、惡性進展中，EGFR作為一種酪氨酸激酶受體在其活化途徑中有受到TM4SF蛋白影響的可能性，兩者可協同調節肺癌細胞的惡性轉化與增殖。本研究結果顯示NET-1和EGFR在肺癌的發生、惡性進展中發揮了不可或缺的作用，且可能存在協同作用，因此二者聯合檢測可作為評估肺癌惡性程度指標。