超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的生物學(xué)特性及其檢測(cè)的研究進(jìn)展

王美英

隨著第三代頭孢類抗生素如頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢他啶在臨床的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性不斷加強(qiáng)，耐藥機(jī)制日益復(fù)雜，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機(jī)制。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum betalactamases，ESBLs)是由質(zhì)粒介導(dǎo)的能賦予細(xì)菌對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的一類酶，本文就ESBLs分類及來(lái)源、特性、流行病學(xué)、檢測(cè)、防治措施等方面綜述如下。

1 ESBLs的型別、來(lái)源及特性

革蘭陰性菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶的種類繁多、特性各異。按照與臨床緊密結(jié)合的BJM分類法，見(jiàn)表1)，可將β-內(nèi)酰胺酶分為 Group l-4，其中 Group 2be(分子分類 class A)為 ESBLs［1］。在全球范圍內(nèi)至少已發(fā)現(xiàn)200多種ESBLs。

表1 β-內(nèi)酰胺酶的分類

1．1 TEM-3 是第一個(gè)被報(bào)道的ESBLs表型，來(lái)源于TEM-1或TEM-2(不包括對(duì)酶抑制劑耐藥的β-內(nèi)酰胺酶，即 IRT)，TEM 型 ESBLs［2］:呈酸性，其等電點(diǎn)(Pl)為:5．2 ～6．5。

1．2 SHV-1 來(lái)源的ESBLs(不包括對(duì)酶抑制劑耐藥的β-內(nèi)酰胺酶，即 SHV-10)有91種。SHV 型 ESBLs［3］:呈弱堿性，其 pl為:7．0 ～8．2;均由質(zhì)粒介導(dǎo)。

1．3 CTX-M型ESBLs 是1990年Bauernfeind首次報(bào)道的一種對(duì)頭孢噻肟(cefotaxime)高水解活性的 ESBLs［4］，命名為CTX-M。CTX-型 ESBLs呈堿性，pI為 7．6 ～8．9，均由質(zhì)粒介導(dǎo)。

1．4 OXA型ESBLs 主要的水解底物是苯唑西林(oxacillin)，因此命名為OXA。OXA型ESBLs屬于分子分類的D類，功能分類方案的2 d群。

1．5 OXA 型 ESBLs［5－8］呈弱酸性或弱堿性，其 Pl為:5．5 ～8．1;大多數(shù)由質(zhì)粒介導(dǎo)。

1．6 其他 包括 PER、SFO、GES、TLA、VEB、BES和 CME 等。至目前己發(fā)現(xiàn)至少12種基因型，這些基因型的流行范圍小，而且檢出率低，它們相互之間以及與其他β-內(nèi)酰胺酶的同源性較低。

1．6．1 PER型ESBLs:在土耳其銅綠假單胞菌中分離出的PER-1是第一個(gè)被報(bào)道的β-內(nèi)酰胺酶。

1．6．2 SFO-1 型 ESBLs:與居泉沙雷菌(Serrana fonticola)產(chǎn)生的A類酶高度相關(guān)。

1．6．3 GES 型 ESBLs:是 Guiana extended-spectrum β-lactamases的簡(jiǎn)稱。GES-l是1998年在法國(guó)Guiana醫(yī)學(xué)中心中臨床分離的一株肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)的，GES-2是2000年在南非的臨床分離的一株銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的，兩者PI為5．8。

1．6．4 TLA-1型ESBLs:是在墨西哥的一株臨床分離大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)的，PI為9．0，由質(zhì)粒介導(dǎo)，對(duì)頭孢噻肟和頭孢他啶耐藥，可明顯被克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦抑制。

1．6．5 VEB 型 ESBLs:是 Vietnamese extended-spectrum-lactamase的簡(jiǎn)稱，也稱CEF-1型酶。VEB-1首次發(fā)現(xiàn)于一越南患兒分離到的大腸埃希菌中，PI為5．35，它對(duì)氧亞氨基β-內(nèi)酰胺抗生素高度耐藥，在泰國(guó)分離到的一株銅綠假單胞菌中也曾發(fā)現(xiàn)。

1．6．6 BES 型 ESBLs:是 Brazil extended-spectrum β-lactamases的簡(jiǎn)稱，首次發(fā)現(xiàn)于巴西臨床分離的18株粘質(zhì)沙雷菌中，Pl為7．5，對(duì)氨曲南、頭孢噻肟和頭孢他啶高度耐藥。

1．6．7 CME型ESBLs:是從腦膜膿毒性黃桿菌(Chryseobacterium meningo-septicum)中分離到的一類ESBLs，由染色體介導(dǎo)，有CME-1和CME-2型，它們對(duì)三代頭孢菌素高度耐藥。

PER-1、PER-2、VEB-1、CME-1 和 TLA-1 之間是相關(guān)的，但僅有40%～50%的同源性，可能來(lái)源于同一個(gè)屬。它們都對(duì)頭孢他啶和氨曲南耐藥。

2 ESBLs的流行病學(xué)

2．1 ESBLs在不同國(guó)家、地區(qū)的分布 ESBLs是第三代頭孢菌素應(yīng)用的產(chǎn)物，20世紀(jì)80年代早期這些抗生素未上市時(shí)，尚無(wú)ESBLs，1984年法國(guó)從肺炎克雷伯菌檢出TEM-3型ESBLs，從此全世界各國(guó)紛紛有檢出ESBLs的報(bào)道，并有爆發(fā)流行趨勢(shì)，但ESBLs的分布各國(guó)存在差異，呈明顯的區(qū)域特征。主要流行的ESBLs型別，德國(guó)和韓國(guó)為 SHV型，美國(guó)、法國(guó)為 TEM型［9］，日本、臺(tái)灣、上海地區(qū)為 CTX-M 型［10］，意大利以 SHV 型、CTX-M型為主［11，12］。但近幾年歐洲地區(qū)逐漸以 CTX-M 為主［13］，美國(guó)以 CTX-M-15 最常見(jiàn)［14］。有資料顯示，CTX-M 型是我國(guó)產(chǎn)ESBLs菌株的主要基因型［15］。北京、上海、杭州、廣州、吉林等地都有CTX-M型酶的報(bào)道。由于各地區(qū)所用抗菌藥物不同，所流行的CTX-M基因亞型也有所差異。

2．2 ESBLs在不同細(xì)菌間的分布 大多ESBLs是在腸桿菌科細(xì)菌特別是大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中檢出，大腸埃希菌是產(chǎn)生ESBLs的代表菌種，但不同型ESBsL在細(xì)菌間的分布有所不同。

2．2．1 TEM型ESBLs:多由大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌產(chǎn)生。但最近發(fā)現(xiàn)其他腸桿菌科細(xì)菌也可產(chǎn)生，如產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌等。另外，在非腸桿菌科細(xì)菌中亦有檢出TEM型酶的報(bào)告。

2．2．2 SHV型酶:多由肺炎克雷伯菌產(chǎn)生，但在差異檸檬酸桿菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌等中亦有發(fā)現(xiàn)。CTX-M型酶:多從大腸埃希菌、克雷伯菌、沙門菌中分離出來(lái)，但在產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌中也有發(fā)現(xiàn)。

2．2．3 OXA型酶大多在銅綠假單孢菌中檢出，很少有在腸桿菌中檢出的報(bào)道。

2．2．4 PER型酶:在在銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、不動(dòng)桿菌屬、沙門菌屬中發(fā)現(xiàn)。其他型酶在常見(jiàn)細(xì)菌中很少見(jiàn)。

2．3 ESBLs在醫(yī)院病區(qū)間的分布 ESBLs菌感染在醫(yī)院不同科室中的分布存在一定的規(guī)律。ESBLs的發(fā)生率常以醫(yī)院ICU、神經(jīng)內(nèi)科、老干部病房及呼吸科為最高，小兒ESBLs菌感染處于較高水平［15］。追究其原因，與這些病房患者病情較重、免疫力低下、合并基礎(chǔ)疾病、侵襲性操作以及免疫抑制劑的應(yīng)用等因素有關(guān)。大多數(shù)研究者認(rèn)為，引起ESBLs流行有如下危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。

表2 臨床ESBLs流行危險(xiǎn)因素

3 ESBLs的檢測(cè)及影響因素

目前除大腸埃希菌、克雷伯菌屬及奇異變形桿菌的ESBLs檢測(cè)有NCCLS推薦法外，其余革蘭陰性菌則沒(méi)有NCCLS推薦的ESBLs檢測(cè)方法，到目前為止，已建立了多種檢測(cè)方法［16］。

3．1 初篩實(shí)驗(yàn) 通常由常規(guī)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)產(chǎn)ESBLs細(xì)菌。常用的方法為紙片擴(kuò)散法或肉湯稀釋法，前者根據(jù)抑菌圈的大小，后者根據(jù)MIC的值來(lái)推測(cè)。此法簡(jiǎn)單、易行，但準(zhǔn)確性差，并且許多產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌對(duì)于檢測(cè)藥物的敏感性無(wú)顯著減低，易導(dǎo)致假陰性，因而此法只能作為ESBLs的篩選試驗(yàn)。

3．1．1 常規(guī)藥敏紙片法:抗菌藥物直徑為頭孢他啶(CAZ)≤22 mm，頭孢曲松(CRO)≤25 mm，頭孢噻肟(CTX)≤27 mm，氨曲南(AZT)≤27 mm，頭孢吡肟(FEP)≤22 mm，以上5種抗生素中任一種符合疑為ESBLs菌株。

3．1．2 MIC肉湯法:以上任一種抗生素 MIC≥2 μg/ml即疑為ESBLs菌株。NCCLS 2000 建議頭孢泊肟 (CPD)≥1 μg/ml，可初篩ESBLs。雖然CPD在治療上無(wú)意義但在耐藥性監(jiān)測(cè)卻有獨(dú)到之處。

3．1．3 雙紙片協(xié)同試驗(yàn)初篩:將阿莫西林/棒酸紙片置培養(yǎng)皿中央，在其周圍20 mm處貼頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松和氨曲南紙片(抗生素紙片購(gòu)自O(shè)xoid公司)，35℃培養(yǎng)18 h，如在阿莫西林/棒酸紙片與其周圍任何一種紙片間出現(xiàn)協(xié)同抑菌作用視為ESBLs初篩陽(yáng)性。雙紙片協(xié)同試驗(yàn)簡(jiǎn)便易行，且成本低，適合臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。

3．2 確證試驗(yàn)

3．2．1 雙紙片擴(kuò)散法:頭孢他啶和頭孢他啶/克拉維酸，頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸2組藥物進(jìn)行測(cè)定比較，加抑制劑后抑菌環(huán)直徑與單藥時(shí)抑菌環(huán)直徑之差＞5 mm即為 ESBLs菌株。

3．2．2 E-test法:E-test法是瑞士 AB Biodisk公司推出一種商品化的ESBL檢測(cè)試紙條。E-test試條包括含有及不含棒酸的頭孢他啶、頭孢噻肟和氨曲南，棒酸能使MIC值降低8倍以上者為陽(yáng)性。E-test檢測(cè)融合了肉湯稀釋法和紙片擴(kuò)散法的優(yōu)勢(shì)，無(wú)需特殊設(shè)備，操作簡(jiǎn)單不用作繁瑣的稀釋而能直接報(bào)告MIC值(具有7個(gè)連續(xù)的藥物濃度梯度)，而且基本不受接種菌量、細(xì)菌生長(zhǎng)期以及低酶菌株等影響。

3．2．3 等電聚焦(isoelectric focusing，IEF):將臨床分離菌中初篩的ESBLs進(jìn)行IEF，測(cè)定其pI與已知酶的pI進(jìn)行比較，具有同一pI的酶可能為同一種酶，如不同則可能為一種新的ESBLs。此法是一種直接、客觀的方法，但由于許多新酶與原有酶的pI相同或相近，大多難以用IEF來(lái)進(jìn)行區(qū)別，只可作為一種粗篩方法。

3．2．4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE):實(shí)驗(yàn)菌液培養(yǎng)后加溶菌酶與低熔點(diǎn)瓊脂混合制成膠塊，然后進(jìn)行溶菌酶切、電泳、染色，分析條帶計(jì)算菌株之間的相似性系數(shù)。如有1～3帶的差別，說(shuō)明細(xì)菌間存在單一基因的差異，細(xì)菌種系密切相關(guān);有4～6條帶的差別，代表細(xì)菌有兩個(gè)獨(dú)立基因的差異，細(xì)菌種系可能相關(guān);有6條以上條帶的差別，則說(shuō)明細(xì)菌之間存在3個(gè)以上基因的不同，那么被測(cè)細(xì)菌種系無(wú)關(guān)聯(lián)。此法分辨率高、重復(fù)性好，是目前最為理想的研究流行病學(xué)的分子分型方法。但是細(xì)胞融解過(guò)程和DNA酶切過(guò)程對(duì)結(jié)果有影響。

3．2．5 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):提取待測(cè)菌的DNA作為擴(kuò)增模板，采用已知標(biāo)準(zhǔn)酶基因的特異性引物，進(jìn)行體外循環(huán)擴(kuò)增，結(jié)果如為陽(yáng)性說(shuō)明有已知ESBLs的產(chǎn)酶基因。此法靈敏度高，但可出現(xiàn)假陽(yáng)性，也無(wú)法發(fā)現(xiàn)新的ESBLs基因，且也無(wú)法將廣譜酶(TEM-1/2、SHV-1)和ESBLs區(qū)分開(kāi)來(lái)。

3．2．6 核苷酸序列分析:將產(chǎn)酶基因進(jìn)行核苷酸序列分析，分析結(jié)果與已知的產(chǎn)ESBLs基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)相同或新的ESBLs基因。此法精密度高，是檢測(cè)ESBLs的金標(biāo)準(zhǔn)，可以發(fā)現(xiàn)新的ESBLs基因以及了解基因突變產(chǎn)生衍生酶的情況。

3．2．7 其他:此外還有Vitek測(cè)試法、三維測(cè)試法、DNA探針、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-single strand conformation polymorphi-sm，PCR-SSCP)、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)等方法。

4 不同的ESBLs細(xì)菌耐藥機(jī)制

不同的ESBLs對(duì)抗菌素耐藥主要是由于各自基因序列發(fā)生了點(diǎn)突變，這些點(diǎn)突變導(dǎo)致個(gè)別酶結(jié)構(gòu)中個(gè)別氨基酸的轉(zhuǎn)變。

4．1 酶的基因突變擴(kuò)大催化腔的空間結(jié)構(gòu)，使第三代頭孢菌素能夠進(jìn)入而被水解。

4．2 酶的基因突變提高對(duì)第三代頭孢菌素的親和力。

4．3 基因單點(diǎn)或多點(diǎn)突變衍生大量的新型超廣譜酶。

4．4 啟動(dòng)子的變化。突變發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因以外的區(qū)域，多數(shù)為啟動(dòng)基因或調(diào)節(jié)基因，往往造成結(jié)構(gòu)基因的過(guò)度表達(dá)，使產(chǎn)酶量增加而導(dǎo)致耐藥。

4．5 孔蛋白的缺失 某些細(xì)菌由于膜孔蛋白較少或蛋白通道較小，使某些抗菌藥物不能進(jìn)入菌體內(nèi)部，或使β-內(nèi)酰胺抑制劑及其他成分進(jìn)入被延遲，使抗生素在接觸靶位前β-內(nèi)酰胺酶有更多的時(shí)間攻擊β-內(nèi)酰胺抗生素，產(chǎn)生所謂“內(nèi)在性耐藥”或稱“固有性耐藥［17］”。

4．6 主動(dòng)外排機(jī)制 是造成ESBLs肺炎克雷伯菌形成多重耐藥的重要原因。

5 ESBLs細(xì)菌的耐藥性及抗菌治療

產(chǎn)ESBLs菌株耐藥問(wèn)題已成為全球最重要的醫(yī)院內(nèi)耐藥問(wèn)題之一，兒科醫(yī)生面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，因許多抗菌藥物對(duì)兒童的潛在不良反應(yīng)［18］，使兒科選藥范圍受到更多局限，其后果是病原菌的耐藥性更快增加。由于產(chǎn)ESBLs菌株具有多重耐藥，導(dǎo)致臨床治療更加困難。因此凡臨床分離的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌均應(yīng)監(jiān)測(cè)是否為產(chǎn)ESBLs株，若肯定，無(wú)論體外對(duì)3代頭孢菌素、氨曲南的藥敏結(jié)果如何，均應(yīng)報(bào)告為對(duì)其耐藥，即一旦確定為產(chǎn)ESBLs菌株，應(yīng)首選亞胺培南等碳青酶烯類或哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦等頭孢菌素類、青霉素和酶抑制劑的復(fù)方制劑治療，可根據(jù)藥敏合并使用氨基糖苷類抗生素;若為IRH菌株則不能使用酶抑制劑的復(fù)方制劑治療。

6 防治措施

細(xì)菌在抗生素選擇性壓力下，通過(guò)基因突變不斷產(chǎn)生新的ESBLs細(xì)菌，并在各菌株間傳播引起爆發(fā)流行。Paterson等［19］的研究再次證明ESBLs細(xì)菌可以在患者之間傳播，因此要加強(qiáng)控制、消毒、隔離等措施。

綜上所述，既然產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌的耐藥問(wèn)題是當(dāng)前全球重要的醫(yī)院內(nèi)耐藥問(wèn)題之一，且易在醫(yī)院內(nèi)發(fā)生區(qū)域性流行，所以要解決革蘭陰性菌(尤其是腸桿菌科)產(chǎn)ESBLs的問(wèn)題，應(yīng)該限制第三代頭孢菌素的應(yīng)用，同時(shí)加強(qiáng)宣傳以提高醫(yī)護(hù)人員對(duì)ESBLs的認(rèn)識(shí)，從而自覺(jué)遵守抗生素的應(yīng)用原則，并采取相應(yīng)的措施來(lái)防治產(chǎn)ESBLs菌的傳播。

1 Bush K，Jacogy HA，Mederiros AA．A functional classitication scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure．Antimicrob Agents Chemother，1995，39:1211-1233．

2 Goussard S，Ccourvalin PP．Uupdated sequence information for TEM lactamases genes．Antimiorcrob Agents Chemother，1999，43:367-370．

3 Bradford PA．Automated thermal cycling is superior to tradicional methods for nucleotide sequencing of blashv genes．Antimicrob Agents Chemother，1999，43:2960-2963．

4 Bonnet R，Dutour C，Sampaio JLM，et al．Novel cefotaximase(CTX-M-16)with increased catalytic efficiency due to substitution Asp-240．Gly Antimicrob AGENTS Chemother，2001，45:2269-2275．

5 Poirel L，Girlich D，Nass T，et al．OXA-28，an extended-spectrum variant of OXA-10β-lactamase from pseudomonas aeruginosa and its plasmid-and integron-located gene．Antimicrob Agents Chemother，2001，45:447-453．

6 Ouellette M，Bissonnette L，Roy PH．Precise insertion of antibiotic resistance determinants into Tn21-like transposons:nucleotide sequence of the OXA-1 lactamase of OXA-lactamase gene．Proc Ncatl Acad Sci USA，1987，84:7378-7382．

7 Aubert D，Poirel L，Chevalier J，et al．Oxacilinase-mediated resistance to cefeoime and susceptibility to ceftazidime in Pseudomonas aeruginnosa．Antimicrob Agents Chemother，2001，45:1615-1620．

8 Aubert D，Poirel L，Ali AB，et al．OXA-35 is an OXA-10-related beta-lactamase from Pseudomonas aeruginoa J Antimicrob Chemother，2001，48:717-721．

9 Yagi T，Kurokawa H，Shibata N，et al．A preliminary survey of extended spectrum beta-lactamases(ESBLs)in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan．FEMS Microbiol Lett，2000，184:53-56．

10 孫景勇，倪語(yǔ)星．大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因分型．中國(guó)抗感染化療雜志，2002，2:211-214．

11 Bagattini M，Crivaro V，Di Popolo A，et al．Molecular epidemiology of extended-spectrum beta-lactamases-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit．J Antimicrob Chemother，2006，57:979-982．

12 Mugnaioli C，Luzzaro F，De Luca F，et al．CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases in itly:molecular epidemiology of an emrtging countrywide problem．Antimicrob Agents Chemother，2006，50:2700-2706．

13 Coque TM，Baquero F，Canton R．Increasing prevalence of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Europe．Euro Surveill，2008，27:19051．

14 Lewis II JS，Herrera M，Wickes B，et al．First report of the emergence of CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases(ESBLS) asthe predo-minant ESBL isolated in a U．S．Health care system．Antimicrob Agents Chemother，2007，51:4015-4021．

15 李萬(wàn)華，秦慧宏，張泓，等．產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌兒童分離株的耐藥性和基因型檢測(cè)．中華感染與化療，2009，9:355-359．

16 Steward CD，Rasheed JK，Hubert SK，et al．Characterization of clinicalisolates of Klebsiella pneumoniae from 19 laboratories using the National Committee for Clinical Laboratory Standards extended spectrum betalactamase detection methods．J Clin Microbiol，2001，39:2864-2872．

17 童明慶，劉根焰．細(xì)菌耐藥與臨床對(duì)策．臨床檢驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，2005，6:32-33．

18 鄒英，夏培元，張杰．1668例住院患者抗生素使用分析．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，428:724-725．

19 Paterson DI，Ko WC，Von Gottberg A，et al．International prospective study of Klebsiella pneumoniae bacteremia implications of extended spectrum beta-lactamase production in nosocomial infections．Ann Intern Med，2004，140:26-321．