二甲基聯苯胺對斑馬魚胚胎發育及成活率的影響

陳文利 趙梅 楊麗莉 高麗蕙 王合全 王建佳 高翔 陳昌生

·論著·

二甲基聯苯胺對斑馬魚胚胎發育及成活率的影響

陳文利 趙梅 楊麗莉 高麗蕙 王合全 王建佳 高翔 陳昌生

目的應用模式生物斑馬魚的胚胎發育技術，研究3，3’-二甲基聯苯胺對魚類胚胎發育的毒性作用和成活率影響。方法受試化合物用甲醇貯備液和蒸餾水配制成水溶液，甲醇含量低于0.3%。設空白對照和甲醇溶劑對照各一個，3，3’-二甲基聯苯胺的毒性試驗濃度分為 2.16、4.32、6.48、8.64、10.68 mg/L 5個，分別選用20 ml的磨口瓶避光貯存。斑馬魚受精卵收集后馬上進行藥物暴露浸洗試驗，每個磨口瓶內放入15枚新采集的受精卵。然后分別放在溫度為(28±1)℃的光照培養箱中培養。每2小時觀察一次，每次隨機抽取3枚受精卵，進行拍照，并顯微觀察不同濃度的二甲基聯苯胺對斑馬魚受精卵及其胚胎發育過程的影響。結果4.32 mg/L以上濃度的藥物處理組的斑馬魚受精卵在胚胎發育早期或卵期就全部死亡，病死率達到100%;2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯苯胺可以引起半數斑馬魚受精卵及其胚胎發育的死亡，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯苯胺對斑馬魚的胚胎發育有一定的加速作用。結論高濃度的二甲基聯苯胺對斑馬魚的受精卵及其胚胎發育有嚴重的毒害和致死作用，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯苯胺對斑馬魚的胚胎發育可能有一定的加速作用。

3，3’-二甲基聯苯胺;斑馬魚;胚胎發育;成活率

聯苯胺類化合物屬于芳香胺類化學物質，在樹脂、橡膠、染料等化工產業合成中有廣泛應用。以及印染織物的漂洗等多種途徑進入環境。由于首先在職業人群中發現膀胱癌的發病率較高，故引起了科學家對聯苯胺類化學物質的關注。陳紀綱通過連續18年的健康監護，采用病例對照研究發現聯苯胺的職業接觸人群中膀胱癌發病率超過1%，是膀胱癌的高危人群［1］。李健等［2］通過用3，3－二氯聯苯胺對 A 系小鼠經口灌胃，發現可以導致小鼠惡性腫瘤如肺癌、肝膽癌等發生率增高，研究表明這類化合物對哺乳動物具有直接或潛在的致癌作用，關于聯苯胺類化合物對水生生物的毒性研究也有一些報道［3］。近年來斑馬魚胚胎毒性試驗以其特有的優勢正逐步成為急性毒性試驗的替代手段［4，5］，目前有關 3，3’-二甲基聯苯胺對斑馬魚胚胎發育影響還未見研究報道。本研究通過對斑馬魚胚胎的急性毒性試驗，觀察胚胎發育期間二甲基聯苯胺暴露所導致魚卵形態及最終孵化率和成活率的變化，探索其敏感性指標，以填補此類化合物對水生生物毒性數據研究的短缺，進一步完善聯苯胺類化合物對水生生物的毒性研究資料，并可為環境衛生標準和職業衛生標準的制定提供科學依據，也為致癌研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 二甲基聯苯胺(3，3’-二甲基聯苯胺)由石家莊市職業病防治院提供。分析純，性能穩定，在水溶液內基本不發生水解、氧化、光解等反應，符合水生毒理學試驗要求。

1.2 試驗用魚及其受精卵的采集 斑馬魚為6個月齡以上，體長4 cm左右的紅色品種親魚。按照雌雄魚數量約為1∶1的比例放養在25 cm×25 cm×30 cm的玻璃水族箱中，控制溶氧0.6 mg/L以上，水溫(26±1)℃，pH 值 8～8.5，水硬度 28～32°dH，光暗比13 h∶11 h。每天喂2次經紫外線消毒處理過的紅線蟲(水絲蚓)。在缸底鋪放一層卵石，以誘發親魚自然繁殖產卵受精。根據其間隔性產卵的特點而進行不間斷的觀察，以便及時收集受精卵并轉移到預先配制好的蒸餾水內。為盡量避免自來水中所含物質干擾試驗結果，受精卵和胚胎發育試驗的用水，均為統一配制、充氧飽和、溫度恒定的蒸餾水。未受精卵在1～2 h內會變為乳白色，用吸管及時剔出。

1.3 儀器設備 (1)DMBA300-C數碼照相顯微鏡;(2)光照培養箱;(3)可控溫加熱器;(4)充氧泵;(5)水族箱等。

1.4 方法 按照OECD的要求設計胚胎毒性試驗［6］，受試化合物用甲醇貯備液和蒸餾水配制成水溶液，甲醇含量低于0.3%。設空白對照和甲醇溶劑對照各1個，3，3’-二甲基聯苯胺的毒性試驗濃度分為 2.16、4.32、6.48、8.64、10.68 mg/L 5個，分別選用20 ml的磨口瓶避光貯存。根據以往的研究，胚胎對芳香族化合物的吸收隨著暴露濃度的增大和時間延長胚胎體內的化合物含量不斷增大直至死亡，而在胚胎發育早期更容易吸收。一般認為，器官早期(原腸胚期前，受精后0～8 h)胚胎對致畸原最為敏感［7］。因此，受精卵收集后馬上進行藥物暴露浸洗試驗，每個磨口瓶內放入15枚新采集的受精卵。然后分別放在溫度為(28±1)℃的光照培養箱中培養。每2小時觀察1次，觀察、統計不同藥物濃度處理后在不同發育時間內受精卵的發育過程、病死率和成活率等，每次隨機抽取3枚受精卵，進行顯微觀察和拍照。

2 結果

2.1 不同濃度的二甲基聯苯胺對斑馬魚受精卵及其胚胎發育過程的影響 見表1。

表1 不同濃度二甲基聯苯胺處理下斑馬魚受精卵及其胚胎發育的狀況

2.2 不同濃度二甲基聯苯胺對斑馬魚胚胎發育成活率的影響見表2。

表2 不同濃度二甲基聯苯胺處理下斑馬魚胚胎發育的成活率

3 討論

根據靜態觀察標準，參照蔡翔等［8］的方法，把斑馬魚的早期胚胎發育過程分為3個時期:(1)單細胞期。受精卵外有較厚的透明膠膜，卵內密布卵黃顆粒。受精后10 min動物極出現。(2)囊胚期。卵裂后期，胚盤卵裂球數漸增，卵裂球間的細胞界限漸變模糊，胚盤高矗于卵黃上，此即囊胚早期。到囊胚晚期，囊胚表面細胞向卵黃部分下包，胚盤變成弓狀。(3)原腸胚期。胚盤細胞下包至卵黃1/2處時，整個囊胚邊緣處形成略厚的胚環，其上層細胞為外胚層，下層細胞為內胚層，胚環背側增厚形成胚盾。

表1可見，在2 h內，由于暴露處理時間很短，各處理組的受精卵沒有明顯的變化，受精卵呈透明狀，能看到卵的動物極出現2或4個細胞的卵裂早期現象。蒸餾水對照組和甲醇溶劑(≤0.3%)對照組的受精卵在每個時間段內基本都能夠正常的發育，依次經歷囊胚期、原腸期、體腔的形成、體節分化、魚形期，至到孵化為仔魚。說明低于0.3%濃度的甲醇助劑，不會造成斑馬魚胚胎發育的異常。2.16 mg/L藥物處理組的受精卵也能按照上述發育歷程發育并孵化出仔魚，但是整個發育時間比對照組提前大約24 h，并且還有一些身體微小、頭大尾小的畸形個體出現。這和以往的研究有相似之處，劉紅玲等［8］提出低濃度的二甲基聯苯胺能促進胚胎發育，而高濃二甲基聯苯胺則抑制胚胎發育。有關低濃度的二甲基聯苯胺為何能加速胚胎發育，導致畸形個體出現有待今后進一步的研究。

4.32 mg/L藥物處理組的斑馬魚卵少數能夠發育為囊胚，但4 h后多數出現囊胚的變形，隨后就是卵黃的凝聚與胚胎死亡，8～12 h內，胚胎全部死亡。6.48 mg/L以上藥物處理組的受精卵都不能發育為囊胚期，很早就表現出明顯的卵黃凝聚反應而使受精卵快速死亡。這說明4.32 mg/L左右的3，3’-二甲基聯苯胺可能是斑馬魚受精卵和胚胎發育的致死的臨界濃度。死亡的受精卵或胚胎都表現出卵黃凝聚，這可能是高濃度的二甲基聯苯胺類物質能夠引起蛋白質的變性所導致的。以往的研究認為，在受精后0～8 h，原腸胚之前這段時間內，胚胎被暴露在高濃度的有毒化合物中，可能會導致遺傳物質改變或蛋白質的凝聚反應，這種損傷是不可修復的［9］。

由表2可見，蒸餾水對照和甲醇溶劑對照處理下，斑馬魚受精卵胚胎發育的成活率分別達到了96.8%和96.4%，差異無統計學意義(P＞0.05)。進一步說明了低于0.3%的甲醇溶劑對魚卵發育沒有明顯影響，可以作為有機物水環境染毒實驗的安全助溶劑。

4.32 mg/L以上濃度的藥物處理組的斑馬魚受精卵在胚胎發育早期或卵期就全部死亡，病死率達到100%，說明高濃度的3，3’-二甲基聯苯胺對魚卵及其胚胎毒性作用很強。2.16 mg/L的二甲基聯苯胺暴露處理后，有約1/2的胚胎死亡或致畸而死，還有約1/2的受精卵(46.8%)能夠發育并孵化為仔魚，基本說明該濃度可能是影響斑馬魚受精卵及其胚胎發育的臨界濃度。2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯苯胺可以作為影響水生生物生存的一個限定指標。(1)低于0.3%(體積分數)濃度的甲醇溶液，對斑馬魚的受精卵和胚胎發育無明顯影響，可作為有機物水環境染毒實驗的安全助溶劑。(2)高濃度的3，3’-二甲基聯苯胺對斑馬魚的受精卵及其胚胎發育有嚴重的毒害和致死作用，4.32 mg/L左右可以使是斑馬魚受精卵及其胚胎發育全部致死，因此該濃度可能是一個致死臨界濃度。(3)2.16 mg/L 3，3’-二甲基聯苯胺可以引起半數斑馬魚受精卵及其胚胎發育的死亡，可以作為影響和評價水生生物生存的一個限定性毒理指標。(4)除了致死和致畸作用外，2.16 mg/L低濃度的3，3’-二甲基聯苯胺對斑馬魚的胚胎發育可能有一定的加速作用，有待今后進一步研究。

1 陳紀剛.上海市聯苯胺接觸人群職業性膀胱癌的醫學監護.中國腫瘤，2001，10:206-209.

2 李健，黃超，竇桂榮.3，3-二氯聯苯胺經口誘發A系小鼠實驗腫瘤的觀察.癌變·畸變·突變，2003，15:81-84.

3 Schulte C，Nagel R.Test acute toxicity in the embryo of zebrafish，Brachydanio rerio，as an alternative to the acute fish test:Preliminary results.ATLA，1994，22:12-19.

4 朱琳，史淑潔.斑馬魚胚胎發育技術在毒性評價中的應用.應用生態學報，2002，13:252-254.

5 端正花，張斌田，朱琳.雙酚A對斑馬魚胚胎發育各階段的毒性及生物蓄積.中國環境科學，2008，28:260-263.

6 OECD.Guideline for testing of chemicals:Fish，embryo toxicity test with the zebrafish(Brerio).OECD，1996，62-76.

7 劉紅玲，于紅霞.聯苯胺類化合物對斑馬魚胚胎發育毒性的初步研究.生態毒理學報，2007，2:94-99.

8 蔡翔，王捷，王穎.應用胚胎檢測技術評價氟嗎啉對斑馬魚胚胎—幼體發育的影響.農藥，2005，44:271-273.

R 321-33

A

1002－7386(2011)17－2610－03

10.3969/j.issn.1002 －7386.2011.17.021

項目來源:河北省科技支撐計劃項目(編號:072761891)

050031 河北省石家莊市職業病防治院(陳文利、楊麗莉、高麗蕙);河北省自然科學基金委員會(趙梅);河北省水產技術推廣站(王合全);河北師范大學(王建佳、高翔、陳昌生)

1.5 標準及指標 試驗過程中，受精卵的死亡按照發育過程中卵黃出現凝集為準;胚胎死亡按照沒有身體運動、沒有心動、身體變渾不透明為準。成活率以仔魚從胚胎孵化出來之后的成活個體計算。成活率為每百粒卵能發育到48 h并孵化為仔魚的卵數。

2011－03－15)