Nrf2對高脂飲食誘導的大鼠胰島素抵抗的保護作用

趙 麗，趙曙光，李慧艷，唐 華，聞勤生 (第四軍醫大學唐都醫院消化內科，西安 710038;通訊作者，E-mail:wenqsss@yahoo.com.cn.)

近年，非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)發病逐漸增多，已成為全球普遍關注的醫學和社會問題。但NASH發病機制尚未完全闡明，缺乏有效的防治措施。有研究［1］顯示，NASH患者常有胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，IR是NASH的始動因素而不是結果。高脂飲食引起的氧化應激是引起IR重要因素。氧化應激通過激活多種應激敏感通路引起IR，如jun N－末端激酶(jun N-terminal kinase，JNK)通路活化可增加胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)的絲氨酸磷酸化、抑制胰島素刺激的酪氨酸磷酸化，進而抑制胰島素信號通路轉導產生IR。目前認為Nrf2激活是細胞抗擊氧化應激的關鍵步驟，Nrf2通過調節Ⅱ相抗氧化酶在調節細胞氧化應激中發揮重要作用。此前研究表明［2］，姜黃素可以通過激活 Nrf2核轉位，增加具有抗氧化功能的Ⅱ相代謝酶的合成，減低肝細胞氧化應激水平。本實驗通過高脂飲食建立IR大鼠模型，用Nrf2誘導劑姜黃素進行干預，觀察上調Nrf2表達對肝臟氧化應激及IR相關指標的影響，探討Nrf2對IR的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 姜黃素購自美國Sigma公司;牛膽鹽、膽固醇均購自北京奧博星生物技術責任有限公司;羧甲基纖維素鈉、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒均購自南京建成生物有限公司;兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗HO-1多克隆抗體購自美國Abzoom公司;羊抗兔IgG抗體(二抗)購自北京博奧森公司。

1.2 動物及分組 清潔級SD雄性大鼠24只，12周齡，體重(200±30)g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供。適應性喂養1周后隨機分為對照組，模型組和姜黃素干預組各8只。對照組給予普通飼料，模型組及干預組給予髙脂飲食。6周末檢測各組大鼠IR。之后對照組繼續普通飼料喂養，模型組繼續髙脂飲食喂養，干預組給予髙脂飲食加姜黃素灌胃200 mg/(kg·d)，共4周。

1.3 大鼠IR模型 參考鐘嵐等［3］方法配成高脂飼料(在普通飼料基礎上加10%豬油、2%膽固醇及0.5%牛膽鹽)。6周末用胰島素－正常血糖鉗夾術檢測模型組IR。4%戊巴比妥鈉腹腔內麻醉，切開頸部皮膚暴露左頸動脈和右頸靜脈并分別插管。將靜置30 min的插管大鼠頸動脈取血，強生全血糖儀測定基礎血糖值。頸靜脈導管接三通管，另兩端接胰島素和葡萄糖輸液管，恒速輸注胰島素，每5 min測定血糖一次。當血糖值超出基礎值±0.5 mmol/L時，開始輸注10%葡萄糖，調整葡萄糖輸注速率(glucose input rat，GIR)，使血糖值控制在基礎值±0.5 mmol/L。連續3次血糖值均穩定在上述范圍，即達到穩態，持續上述過程達2 h并記錄GIR。

1.4 觀察指標方法

1.4.1 肝組織病理學檢測 肝臟右葉留取部分組織，浸泡于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.4.2 肝功能檢測 大鼠心臟內取血，常規分離血清，用全自動生化分析儀檢測ALT、AST的變化。

1.4.3 GSH和MDA的檢測 大鼠血漿，按照試劑盒說明分別用紫外分光光度法在不同波長下測定GSH、MAD水平。

1.4.4 Western blot檢測 Nrf2、JNK/p-JNK 和 IRS-1/p-IRS-1表達 取蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，按濕轉法將電泳產物轉移到PVDF膜，封閉液中1 h，滴加抗Nrf2一抗(1∶1 000)4℃過夜，TBS/T洗3次(10 min/T)，二抗(1∶3 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜，方法同上，洗去游離二抗。NBT/BCIP顯色，GelDoc凝膠成像儀采集圖像。

2 結果

2.1 大鼠IR模型的建立 胰島素－正常血糖鉗夾實驗顯示模型組大鼠GIR［mg/(kg·min)］明顯低于對照組大鼠(10.88 ±1.61vs21.88 ±1.72，P＜0.01)。

2.2 病理學變化 對照組大鼠肝臟無明顯腫大，外觀色澤呈紅褐色，無明顯異常;模型組大鼠肝臟明顯腫大，外觀色澤黃膩，偶可見局部白色變性灶，邊緣圓鈍，切面油膩;姜黃素干預組肝臟色澤、質地、體積較模型對照組均有所改善。光鏡下觀察，對照組大鼠肝組織結構完整、清晰，肝小葉結構正常，肝細胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，細胞呈多邊形;模型組大鼠部分肝細胞內可見脂滴聚積，見少量炎細胞浸潤，多位于匯管區，以淋巴細胞為主;姜黃素干預組脂肪變性及炎癥表現均輕于模型組。

2.3 血清 ALT、AST、MDA、GSH 變化 模型組ALT、AST、MDA 較對照組顯著升高(P＜0.01)，姜黃素干預組ALT、AST、MDA較模型組顯著降低(P＜0.01)，但干預組水平仍高于對照組(P＜0.01);模型組GSH較對照組顯著降低(P＜0.01)，干預組GSH較模型組顯著升高(P＜0.01)，但干預組仍低于對照組(P＜0.01，見表1)。

2.4 肝臟 Nrf2、JNK、p-JNK、IRS-1 和 p-IRS-1 變化對照組細胞核中Nrf2表達較少，模型組胞核中Nrf2表達較對照組有所增加，姜黃素干預組細胞核中Nrf2表達較對照組及模型組均明顯增加。模型組的p-JNK水平較對照組增高，干預組p-JNK水平較模型組減少，介于模型組和對照組之間，JNK在各組間則未見明顯變化;模型組的p-IRS-1水平較對照組減少，干預組p-IRS-1水平較模型組增高，但仍低于對照組水平;IRS-1各組間未見明顯變化(見圖1，表2)。

表1各組AST、ALT、MDA和GSH水平比較±s)Tab 1Comparison of AST，ALT，MDA and GSH among 3 groups(±s)

表1各組AST、ALT、MDA和GSH水平比較±s)Tab 1Comparison of AST，ALT，MDA and GSH among 3 groups(±s)

與對照組比較，#P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.01

AST/(U/L) ALT/(U/L) MDA/(nmol/ml) GSH/(mg/l)對照組 134.88 ±3.30 26.88 ±2.68 4.49 ±2.72 28.45 ±2.72模型組 240.13 ±8.93# 86.88 ±6.47# 7.61 ±0.44# 6.74 ±2.63#干預組 181.38 ±5.67#* 49.63 ±2.51#* 5.88 ±0.69#* 16.03 ±3.15#*

圖1 Western blot檢測肝臟 Nrf2、JNK/p-JNK和IRS-1/p-IRS-1的表達Fig 1 The expression of Nrf2，JNK/p-JNK and IRS-1/p-IRS-1 in liver tissues by Western-blot

表2 肝臟 Nrf2、JNK、p-JNK、IRS-1和 p-IRS-1的表達灰度值比較Tab 2 The grey degree of expression of Nrf2，JNK/p-JNK and IRS-1/p-IRS-1 in liver tissues

3 討論

非酒精性脂肪性肝病是一種無過量飲酒史、病變主體在肝小葉，以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、NASH、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化4個病理類型。NASH是由單純性脂肪肝發展至肝纖維化、肝硬化及肝癌的重要中間階段，是一個關鍵的轉折點［4］。IR常存在于NASH患者，IR相關性疾病如腹型肥胖、2型糖尿病及高脂血癥常發生于NASH患者。

本實驗通過髙脂飲食建立大鼠IR模型，并通過葡萄糖鉗夾實驗發現高脂飲食大鼠的GIR明顯低于普通飲食大鼠，說明高脂飲食大鼠對胰島素敏感性降低，存在明顯的胰島素抵抗。同時發現髙脂飲食可引起大鼠體內氧化應激水平增加。MDA作為脂質過氧化產物之一，可以反映體內脂質過氧化的程度。GSH的活性成份為還原型谷胱甘肽，參與體內氧化還原過程同時還可對抗自由基對重要臟器的損害，兩者均反映機體氧化損傷程度。AST，ALT均反映肝臟組織受損程度。本實驗結果模型組MDA、AST、ALT明顯較對照組增加，干預組介于兩者之間。模型組GSH較對照組降低，干預組介于兩者之間。實驗結果證實髙脂飲食可引起大鼠體內氧化應激水平增加，并進一步引起肝組織的氧化應激損傷。

有研究顯示［5］高脂飲食引起的氧化應激是引起IR重要因素。氧化應激可以激活細胞內的一系列應激信號通道如JNK、PKC等。其中JNK通過作用于IRS-1減少胰島素刺激的酪氨酸磷酸化從而抑制胰島素信號的轉導［6］。本實驗結果顯示，模型組的JNK磷酸化水平較對照組增高，姜黃素干預組JNK磷酸化水平較模型組減少，介于模型組和對照組之間，非磷酸化的JNK各組間未見明顯變化。模型組的IRS-1磷酸化水平較對照組減少，干預組IRS-1磷酸化水平較模型組增高，但仍低于對照組水平;非磷酸化的IRS-1各組間未見明顯變化。實驗結果證實髙脂飲食可導致氧化應激水平的增加，JNK通路的激活參與了IR的形成，髙脂飲食引起的氧化應激是IR發生的重要因素，姜黃素干預可明顯減輕IR水平。

我們在前期研究中［7，8］證實通過誘導Nrf2核轉位的增加，對氧化應激引起的肝細胞損害具有保護作用。研究表明［9，10］Nrf2是細胞抗氧化反應的中樞調節者。生理情況下它和胞質蛋白分子伴侶Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)結合使得活性處于相對抑制狀態。當受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf2從Keap1中解離，然后穩定狀態的Nrf2轉位進入細胞核，與其他的bZIP蛋白結合成異二聚體，異二聚體與基因中的ARE結合轉錄后激活靶基因的表達，產生具有抗氧化作用的Ⅱ相酶從而在調節氧化應激中發揮重要作用。本實驗結果顯示Nrf2在細胞核中的表達對照組較少，模型組較對照組增加，干預組較對照組及模型組均明顯增加。提示誘導Nrf2核轉位可明顯降低肝臟氧化應激水平，從而對肝臟起到保護作用。

本實驗通過觀察Nrf2誘導劑姜黃素對高脂飲食大鼠IR模型的影響，發現Nrf2核轉位能夠改善高脂飲食引起的肝臟組織學、IR及肝功改變，可能與Nrf2核轉位上調Ⅱ相抗氧化的酶的表達，減輕肝臟氧化應激水平，進而降低JNK磷酸化水平、增加IRS-1磷酸化水平有關。本實驗結果為以Nrf2為靶點進行NASH防治提供新的實驗基礎及理論依據。

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