熒光原位雜交技術在膀胱尿路上皮腫瘤病理學診斷中的初步應用

陳順平 劉 偉 余英豪 劉蘇英 陳 霓 謝飛來

尿路上皮癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，且容易復發，遺傳學研究表明尿路上皮癌容易發生染色體畸變［1］。現今，隨著遺傳學在臨床方面的廣泛應用，尿路上皮腫瘤遺傳學改變正逐漸成為臨床病理診斷的關注焦點，而FISH作為臨床常用的遺傳學檢測技術，可直接用于檢測細胞核染色體的改變［2］。目前在膀胱腫瘤方面研究較多是通過檢測尿液細胞學染色體改變情況，以判斷膀胱尿路上皮癌的存在與復發，而對于組織學方面研究較少。本文應用FISH技術，對膀胱不同級別尿路上皮乳頭狀瘤樣病變組織進行檢測，了解3、7、17號染色體及p16基因在這些病變中的非整倍性情況，以期對膀胱尿路上皮腫瘤的病理學診斷及鑒別診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2009年1月～2010年12月、在南京軍區福州總醫院手術切除或膀胱鏡活檢的膀胱腫瘤石蠟包埋組織標本33例，其中男性16例，女性17例，年齡32～75歲，平均48.5歲。按不同乳頭狀瘤樣病變類型分為5組:腺性膀胱炎6例(B組)，內翻性乳頭狀瘤6例(C組)，低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤7例(D組)，非浸潤性膀胱乳頭狀尿路上皮癌5例(E組)，浸潤性膀胱尿路上皮癌9例(F組)。以10例正常膀胱黏膜組織作為對照組(A組)。

1.2 主要儀器和試劑

酸性亞硫酸鈉為美國Simga產品，蛋白酶K為美國羅氏產品，探針(GLP9P16、CSP3、CSP7、CSP17 探針)購自北京金菩嘉公司。Olympus BX51型熒光顯微鏡、Dake原位雜交儀、電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養箱等。

1.3 FISH檢測方法

主要步驟如下:①石蠟組織切片3 μm，置于涂膠玻片上并浸于二甲苯中脫蠟至水;②50℃下30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片30～40 min;③室溫下2×SSC漂洗3 min×2次;④組織上滴加自行配制的即用型蛋白酶K，37℃預熱的孵育盒中消化25～35 min;⑤室溫下2×SSC漂洗3 min×2次，乙醇梯度脫水固定，自然干燥;⑥避光環境下雜交區域滴加探針混合液(7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和 2 μl探針)，83℃自動雜交儀中變性6 min后置37℃過夜雜交。⑦洗滌:移去蓋玻片，46℃下2×SSC漂洗10 min×2次，0.1%NP-40溶液中5 min。待玻片干燥后加DAPI復染液，置暗盒中復染數分鐘。OLYMPUS BX51熒光顯微鏡DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡下觀察期間細胞熒光雜交信號。

1.4 結果判定

①信號判斷:由1名醫師和1名技術員共同觀察記錄結果。每例分析100個散在細胞，以細胞雜交率＞80%為有效標本，細胞重疊、破損及雜交信號微弱細胞核不計數，細胞內雜交信號互相靠近者計為1個信號。確定單個細胞染色體異常的標準為:單個細胞信號數≥3為擴增;≤1為信號缺失。②閾值建立:閾值=平均數(M)+3個標準差(SD)，以正常組為標準建立域值如下:CSP3≥7個異常細胞為擴增;CSP7≥8個異常細胞為擴增;CSP17≥6個異常細胞為擴增;p16≥6個異常細胞為擴增。p16基因≥70個細胞信號缺失為基因缺失。

1.5 統計學分析

應用SPSS17.0軟件進行統計學分析，采用樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組病例3、7、17染色體及p16擴增率與缺失率

浸潤性尿路上皮癌(F組)與其他各組(A～E組)3、7、17染色體及p16擴增率和缺失率比較，均有統計學意義(P均＜0.01);其他各組間比較無統計學意義(P ＞0.05)，見表1。

2.2 各組病例4種探針聯合檢測的異常情況

4種探針聯合檢測≥2個指標異常出現率，浸潤性尿路上皮癌(F組)為100.00%，低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤(D組)為14.29%，非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌(E組)為20.00%，F組與其他5組比較均有統計學意義(P均＜0.01)，見表1。

表1 各組膀胱組織多基因檢測結果(例，%)

2.3 擴增或缺失病例信號差異分析

9例浸潤性膀胱尿路上皮癌中，3、7、17染色體均為非整倍性擴增，擴增率為100.00%(9/9)，且染色體非整倍性情況具有多樣性;信號點數較為密集，提示高擴增。低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤和非浸潤性膀胱尿路上皮癌染色體僅各1例出現染色體異常，而且為低擴增或p16基因部分缺失。

2.4 FISH技術檢測判斷惡性尿路上皮腫瘤的敏感性與特異性

≥2個指標異常浸潤性尿路上皮癌診斷敏感性為81.82%，特異性為91.67%;≥2個指標異常非浸潤性尿路上皮癌診斷敏感性為9.10%，特異性為64.29%。

3 討論

尿路上皮癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，復發率高達70%，在初診時大部分為非浸潤性癌，即使經過切除腫瘤聯合化療藥物或卡介苗膀胱灌注治療后，仍有30% ～40%的患者復發［3］，10% ～15%的復發性非浸潤性尿路上皮癌會進展為浸潤性癌或轉移性癌［4］。因此，對膀胱腫瘤的早期診斷以及對術后復發的監測非常重要，許多研究者都把目光投向分子遺傳學方面，而FISH技術是現今最常應用于尿路上皮癌診斷的分子遺傳學研究方法之一，該方法具有很高的靈敏性及特異性，直觀性和重復性好，2001年7月被FDA批準用于膀胱腫瘤的檢測，其主要用于染色體數目和結構畸變的研究。Sandberg等［5］在1994年對泌尿腫瘤染色體研究認為，尿路上皮癌易發生染色體改變，其中包括結構畸變和染色體數目異常，常見結構畸變染色體有3、9、1、5、11、21、17 號染色體，染色體數異常見于 3、9、7、10、11、Y、1、8、17、15 號染色體。目前臨床上用于診斷尿路上皮癌的常用染色體主要有:3、7、9、17號染色體。此外，尿路上皮癌的發展與染色體不穩定性也緊密相關，特別是3、7 及17 號染色體的非整倍性［4，6］。目前國內外有關FISH技術應用于膀胱尿路上皮腫瘤的大規模的臨床應用研究，都局限于尿路上皮癌的尿液細胞學檢測，而應用于膀胱尿路上皮腫瘤不同病變期組織學染色體改變情況的研究尚未見報道。鑒于不同類型膀胱尿路上皮腫瘤病變，特別是乳頭狀增生性病變在日常病理診斷中既多見，而有時又難以很好把握，特別是個別病例在同一張切片中會同時見到良性乳頭狀增生至浸潤性癌的改變，因此，我們應用FISH技術，對不同類型的膀胱尿路上皮腫瘤組織進行FISH檢測，一方面初步了解染色體在膀胱尿路上皮腫瘤組織學中的非整倍性情況，同時希望對膀胱尿路上皮腫瘤的日常病理診斷及鑒別診斷提供幫助。

本研究選用3、7、17號染色體和9號染色體部的p16基因這4種特異性DNA探針，對33例膀胱尿路上皮腫瘤組織、10例正常對照膀胱組織進行FISH檢測，通過檢測染色體的遺傳學改變，來評估FISH技術在膀胱尿路上皮腫瘤病理診斷中的作用。結果發現，3、7、17染色體及p16擴增率與缺失率方面，浸潤性尿路上皮癌組與其他各組差異均有統計學意義;其他各組(A～E組)間差異無統計學意義;4種探針聯合檢測中有≥2個指標同時出現異常，浸潤性尿路上皮癌(F組)占100.00%、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤(D組)為14.29%、非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌(E組)為20.00%，F組與其他各組差異有統計學意義;≥2個指標同時異常診斷浸潤性尿路上皮癌敏感性為81.82%、特異性為91.67%，這與FISH應用于細胞學方面報道結果相近［7～9］;但是≥2個指標異常診斷非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌敏感性低，僅20%出現基因異常改變。通過進一步分析，我們發現，不同程度不同染色體的非整倍性及p16基因擴增及缺失存在與不同分期的尿路上皮腫瘤中，如低度惡性潛能組及內翻性乳頭狀瘤組亦出現基因異常病例。但隨著組織病變級別的增高，染色體非整倍性更具多樣性，信號點類型表現更為復雜且擴增率更高，而達到浸潤性癌時，3、7、17染色體均為非整倍性擴增，擴增率達100%，這與Bollmann等［10］的研究結果相近。

由此我們認為:①膀胱乳頭狀尿路上皮病變出現染色體非整倍性擴增，且非整倍性情況具多樣性;信號點密集幾乎均見于浸潤性尿路上皮癌;②不同類型的膀胱乳頭狀尿路上皮病變，均可能出現不同程度不同染色體的非整倍性及p16基因擴增及缺失，但良性及非浸潤性癌非整倍性的多樣性及信號點類型復雜程度較低;③即使沒有出現染色體非整倍性擴增的病例，亦不能排除膀胱尿路上皮癌的診斷，而一旦出現FISH陽性改變亦給予高度重視，及時進行必要的干預或密切隨訪;④這4組探針聯合檢測，可用于尿路上皮癌術后病例的監測，但并不能作為早期癌的敏感篩查方法。

由于本研究病例數相對偏少，特別是幾例病理組織學顯示良性病變而出現基因異常的病例，目前臨床意義尚不明確，我們將進行密切的隨訪，同時有必要進行尿液脫落細胞學FISH檢測與病理組織學對比的大宗病例對照研究。

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