熒光原位雜交技術(shù)在膀胱尿路上皮腫瘤病理學(xué)診斷中的初步應(yīng)用

陳順平 劉 偉 余英豪 劉蘇英 陳 霓 謝飛來(lái)

尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，且容易復(fù)發(fā)，遺傳學(xué)研究表明尿路上皮癌容易發(fā)生染色體畸變［1］。現(xiàn)今，隨著遺傳學(xué)在臨床方面的廣泛應(yīng)用，尿路上皮腫瘤遺傳學(xué)改變正逐漸成為臨床病理診斷的關(guān)注焦點(diǎn)，而FISH作為臨床常用的遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)，可直接用于檢測(cè)細(xì)胞核染色體的改變［2］。目前在膀胱腫瘤方面研究較多是通過檢測(cè)尿液細(xì)胞學(xué)染色體改變情況，以判斷膀胱尿路上皮癌的存在與復(fù)發(fā)，而對(duì)于組織學(xué)方面研究較少。本文應(yīng)用FISH技術(shù)，對(duì)膀胱不同級(jí)別尿路上皮乳頭狀瘤樣病變組織進(jìn)行檢測(cè)，了解3、7、17號(hào)染色體及p16基因在這些病變中的非整倍性情況，以期對(duì)膀胱尿路上皮腫瘤的病理學(xué)診斷及鑒別診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2009年1月～2010年12月、在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院手術(shù)切除或膀胱鏡活檢的膀胱腫瘤石蠟包埋組織標(biāo)本33例，其中男性16例，女性17例，年齡32～75歲，平均48.5歲。按不同乳頭狀瘤樣病變類型分為5組:腺性膀胱炎6例(B組)，內(nèi)翻性乳頭狀瘤6例(C組)，低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤7例(D組)，非浸潤(rùn)性膀胱乳頭狀尿路上皮癌5例(E組)，浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌9例(F組)。以10例正常膀胱黏膜組織作為對(duì)照組(A組)。

1.2 主要儀器和試劑

酸性亞硫酸鈉為美國(guó)Simga產(chǎn)品，蛋白酶K為美國(guó)羅氏產(chǎn)品，探針(GLP9P16、CSP3、CSP7、CSP17 探針)購(gòu)自北京金菩嘉公司。Olympus BX51型熒光顯微鏡、Dake原位雜交儀、電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養(yǎng)箱等。

1.3 FISH檢測(cè)方法

主要步驟如下:①石蠟組織切片3 μm，置于涂膠玻片上并浸于二甲苯中脫蠟至水;②50℃下30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片30～40 min;③室溫下2×SSC漂洗3 min×2次;④組織上滴加自行配制的即用型蛋白酶K，37℃預(yù)熱的孵育盒中消化25～35 min;⑤室溫下2×SSC漂洗3 min×2次，乙醇梯度脫水固定，自然干燥;⑥避光環(huán)境下雜交區(qū)域滴加探針混合液(7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和 2 μl探針)，83℃自動(dòng)雜交儀中變性6 min后置37℃過夜雜交。⑦洗滌:移去蓋玻片，46℃下2×SSC漂洗10 min×2次，0.1%NP-40溶液中5 min。待玻片干燥后加DAPI復(fù)染液，置暗盒中復(fù)染數(shù)分鐘。OLYMPUS BX51熒光顯微鏡DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡下觀察期間細(xì)胞熒光雜交信號(hào)。

1.4 結(jié)果判定

①信號(hào)判斷:由1名醫(yī)師和1名技術(shù)員共同觀察記錄結(jié)果。每例分析100個(gè)散在細(xì)胞，以細(xì)胞雜交率＞80%為有效標(biāo)本，細(xì)胞重疊、破損及雜交信號(hào)微弱細(xì)胞核不計(jì)數(shù)，細(xì)胞內(nèi)雜交信號(hào)互相靠近者計(jì)為1個(gè)信號(hào)。確定單個(gè)細(xì)胞染色體異常的標(biāo)準(zhǔn)為:單個(gè)細(xì)胞信號(hào)數(shù)≥3為擴(kuò)增;≤1為信號(hào)缺失。②閾值建立:閾值=平均數(shù)(M)+3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以正常組為標(biāo)準(zhǔn)建立域值如下:CSP3≥7個(gè)異常細(xì)胞為擴(kuò)增;CSP7≥8個(gè)異常細(xì)胞為擴(kuò)增;CSP17≥6個(gè)異常細(xì)胞為擴(kuò)增;p16≥6個(gè)異常細(xì)胞為擴(kuò)增。p16基因≥70個(gè)細(xì)胞信號(hào)缺失為基因缺失。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組病例3、7、17染色體及p16擴(kuò)增率與缺失率

浸潤(rùn)性尿路上皮癌(F組)與其他各組(A～E組)3、7、17染色體及p16擴(kuò)增率和缺失率比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01);其他各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

2.2 各組病例4種探針聯(lián)合檢測(cè)的異常情況

4種探針聯(lián)合檢測(cè)≥2個(gè)指標(biāo)異常出現(xiàn)率，浸潤(rùn)性尿路上皮癌(F組)為100.00%，低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤(D組)為14.29%，非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌(E組)為20.00%，F(xiàn)組與其他5組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)，見表1。

表1 各組膀胱組織多基因檢測(cè)結(jié)果(例，%)

2.3 擴(kuò)增或缺失病例信號(hào)差異分析

9例浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌中，3、7、17染色體均為非整倍性擴(kuò)增，擴(kuò)增率為100.00%(9/9)，且染色體非整倍性情況具有多樣性;信號(hào)點(diǎn)數(shù)較為密集，提示高擴(kuò)增。低度惡性潛能乳頭狀尿路上皮腫瘤和非浸潤(rùn)性膀胱尿路上皮癌染色體僅各1例出現(xiàn)染色體異常，而且為低擴(kuò)增或p16基因部分缺失。

2.4 FISH技術(shù)檢測(cè)判斷惡性尿路上皮腫瘤的敏感性與特異性

≥2個(gè)指標(biāo)異常浸潤(rùn)性尿路上皮癌診斷敏感性為81.82%，特異性為91.67%;≥2個(gè)指標(biāo)異常非浸潤(rùn)性尿路上皮癌診斷敏感性為9.10%，特異性為64.29%。

3 討論

尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，在初診時(shí)大部分為非浸潤(rùn)性癌，即使經(jīng)過切除腫瘤聯(lián)合化療藥物或卡介苗膀胱灌注治療后，仍有30% ～40%的患者復(fù)發(fā)［3］，10% ～15%的復(fù)發(fā)性非浸潤(rùn)性尿路上皮癌會(huì)進(jìn)展為浸潤(rùn)性癌或轉(zhuǎn)移性癌［4］。因此，對(duì)膀胱腫瘤的早期診斷以及對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)非常重要，許多研究者都把目光投向分子遺傳學(xué)方面，而FISH技術(shù)是現(xiàn)今最常應(yīng)用于尿路上皮癌診斷的分子遺傳學(xué)研究方法之一，該方法具有很高的靈敏性及特異性，直觀性和重復(fù)性好，2001年7月被FDA批準(zhǔn)用于膀胱腫瘤的檢測(cè)，其主要用于染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變的研究。Sandberg等［5］在1994年對(duì)泌尿腫瘤染色體研究認(rèn)為，尿路上皮癌易發(fā)生染色體改變，其中包括結(jié)構(gòu)畸變和染色體數(shù)目異常，常見結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w有3、9、1、5、11、21、17 號(hào)染色體，染色體數(shù)異常見于 3、9、7、10、11、Y、1、8、17、15 號(hào)染色體。目前臨床上用于診斷尿路上皮癌的常用染色體主要有:3、7、9、17號(hào)染色體。此外，尿路上皮癌的發(fā)展與染色體不穩(wěn)定性也緊密相關(guān)，特別是3、7 及17 號(hào)染色體的非整倍性［4，6］。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)FISH技術(shù)應(yīng)用于膀胱尿路上皮腫瘤的大規(guī)模的臨床應(yīng)用研究，都局限于尿路上皮癌的尿液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，而應(yīng)用于膀胱尿路上皮腫瘤不同病變期組織學(xué)染色體改變情況的研究尚未見報(bào)道。鑒于不同類型膀胱尿路上皮腫瘤病變，特別是乳頭狀增生性病變?cè)谌粘２±碓\斷中既多見，而有時(shí)又難以很好把握，特別是個(gè)別病例在同一張切片中會(huì)同時(shí)見到良性乳頭狀增生至浸潤(rùn)性癌的改變，因此，我們應(yīng)用FISH技術(shù)，對(duì)不同類型的膀胱尿路上皮腫瘤組織進(jìn)行FISH檢測(cè)，一方面初步了解染色體在膀胱尿路上皮腫瘤組織學(xué)中的非整倍性情況，同時(shí)希望對(duì)膀胱尿路上皮腫瘤的日常病理診斷及鑒別診斷提供幫助。

本研究選用3、7、17號(hào)染色體和9號(hào)染色體部的p16基因這4種特異性DNA探針，對(duì)33例膀胱尿路上皮腫瘤組織、10例正常對(duì)照膀胱組織進(jìn)行FISH檢測(cè)，通過檢測(cè)染色體的遺傳學(xué)改變，來(lái)評(píng)估FISH技術(shù)在膀胱尿路上皮腫瘤病理診斷中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3、7、17染色體及p16擴(kuò)增率與缺失率方面，浸潤(rùn)性尿路上皮癌組與其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其他各組(A～E組)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;4種探針聯(lián)合檢測(cè)中有≥2個(gè)指標(biāo)同時(shí)出現(xiàn)異常，浸潤(rùn)性尿路上皮癌(F組)占100.00%、低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤(D組)為14.29%、非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌(E組)為20.00%，F(xiàn)組與其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;≥2個(gè)指標(biāo)同時(shí)異常診斷浸潤(rùn)性尿路上皮癌敏感性為81.82%、特異性為91.67%，這與FISH應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)方面報(bào)道結(jié)果相近［7～9］;但是≥2個(gè)指標(biāo)異常診斷非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌敏感性低，僅20%出現(xiàn)基因異常改變。通過進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)，不同程度不同染色體的非整倍性及p16基因擴(kuò)增及缺失存在與不同分期的尿路上皮腫瘤中，如低度惡性潛能組及內(nèi)翻性乳頭狀瘤組亦出現(xiàn)基因異常病例。但隨著組織病變級(jí)別的增高，染色體非整倍性更具多樣性，信號(hào)點(diǎn)類型表現(xiàn)更為復(fù)雜且擴(kuò)增率更高，而達(dá)到浸潤(rùn)性癌時(shí)，3、7、17染色體均為非整倍性擴(kuò)增，擴(kuò)增率達(dá)100%，這與Bollmann等［10］的研究結(jié)果相近。

由此我們認(rèn)為:①膀胱乳頭狀尿路上皮病變出現(xiàn)染色體非整倍性擴(kuò)增，且非整倍性情況具多樣性;信號(hào)點(diǎn)密集幾乎均見于浸潤(rùn)性尿路上皮癌;②不同類型的膀胱乳頭狀尿路上皮病變，均可能出現(xiàn)不同程度不同染色體的非整倍性及p16基因擴(kuò)增及缺失，但良性及非浸潤(rùn)性癌非整倍性的多樣性及信號(hào)點(diǎn)類型復(fù)雜程度較低;③即使沒有出現(xiàn)染色體非整倍性擴(kuò)增的病例，亦不能排除膀胱尿路上皮癌的診斷，而一旦出現(xiàn)FISH陽(yáng)性改變亦給予高度重視，及時(shí)進(jìn)行必要的干預(yù)或密切隨訪;④這4組探針聯(lián)合檢測(cè)，可用于尿路上皮癌術(shù)后病例的監(jiān)測(cè)，但并不能作為早期癌的敏感篩查方法。

由于本研究病例數(shù)相對(duì)偏少，特別是幾例病理組織學(xué)顯示良性病變而出現(xiàn)基因異常的病例，目前臨床意義尚不明確，我們將進(jìn)行密切的隨訪，同時(shí)有必要進(jìn)行尿液脫落細(xì)胞學(xué)FISH檢測(cè)與病理組織學(xué)對(duì)比的大宗病例對(duì)照研究。

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