環磷酰胺LDM聯合MTD化療對乳腺癌抗血管作用的實驗研究

陳 伶 鄧金昆 劉 星 史莉莉 李 麗

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，也是典型的血管依賴性疾病，其發生、發展、生長、轉移等均與血管生成密切相關。因此，將血管作為乳腺癌治療的靶點成為研究熱點，抗血管藥物也陸續被研發。近幾年研究顯示，一些化療藥物在低濃度劑量下具有抗血管生成作用，提高抗癌效果且不良反應小，不易產生耐藥，將這種給藥方式稱為低劑量節律化療(low-dose metronomic chemotherapy，LDM)。以往在以傳統的最大耐受量(maximum tolerated dose，MTD)為基礎的化療方案，是通過干擾腫瘤細胞的DNA復制、酶及微管功能或代謝來直接殺滅腫瘤細胞達到抑瘤的效果，因其化療間歇期較長，使正常細胞得以恢復，但同時血管內皮細胞也得以修復，故其抗血管生成作用并沒有帶來良好的療效。本實驗建立裸鼠人乳腺癌模型，將傳統的化療方式MTD與LDM相結合，通過觀察治療后裸小鼠腫瘤組織中TSP-1、MVD及AI表達的變化，以研究環磷酰胺MTD聯合LDM的化療方案，對乳腺癌血管生成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MCF-7由大連醫科大學附屬第一醫院中心實驗室提供。BALB/c-nu裸鼠20只，雌性，4～6周齡，體重16～22 g，購于大連醫科大學動物實驗中心。環磷酰胺注射液粉劑購于江蘇恒瑞醫藥有限公司，大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體購于美國Biolegend公司，兔抗小鼠TSP-1單克隆抗體購于武漢博士德生物技術有限公司，TUNEL凋亡試劑盒購于南京凱基生物技術有限公司。免疫組化相關試劑盒購于北京中杉生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 將人乳腺癌細胞株MCF-7細胞接種于含10%胎牛血清的IMDM培養基中，于5%CO2、37℃、飽和濕度的孵箱中培養，于對數生長期將其調至細胞濃度為6×107個/ml的MCF-7細胞懸液，按0.2 ml/只接種于裸鼠右側胸壁乳墊下，待腫瘤體積長到150～200 mm3時開始分組用藥。

1.2.2 實驗分組及用藥 將20只荷瘤裸鼠隨機(隨機數字表法)分成4組，每組5只，A組(LDM單藥組)CTX 20 mg/kg，qd，ip，共 21 d;B 組(LDM+MTD 聯合組)CTX 150 mg/kg，qod，ip，共 3 次，隔天予 CTX 20 mg/kg，qd，ip，共21 d;C 組(MTD 單藥組)CTX 150 mg/kg，qod，ip，共3 次，共21 d;D 組(生理鹽水組)NS等體積，qd，ip，共 21 d。

1.2.3 組織取材及病理切片檢查 用藥結束采用頸椎脫臼法處死裸鼠，在無菌條件下剝離瘤組織，稱重。瘤標本離體后，15 min內浸泡于10%的中性福爾馬林液中，常溫下固定8～24 h，石蠟包埋，2 μm連續切片，行HE染色，CD34、TSP-1免疫組織化學染色及TUNEL凋亡檢測(按說明書操作)。

1.2.4 結果評定標準 用藥期間，每周尾靜脈采血計數外周血白細胞數，隔天測量腫瘤體積，用游標卡尺測量腫瘤最大直徑(a)及與之相垂直的橫徑(b)，根據公式V(mm3)=1/2ab2，計算出腫瘤相對體積并繪制腫瘤生長曲線。用藥結束后，脫頸處死裸鼠，稱瘤重，并計算瘤質量抑瘤率，抑瘤率=(對照組重量－實驗組重量)/對照組重量×100%。

MVD 判定:按照 Weidner［1］的微血管判斷標準，低倍鏡確定腫瘤組織內微血管密度最密集的視野(新生血管熱點區)，高倍鏡10×20視野范圍內計數所有染色的微血管，取4個視野計數結果的均值。

TSP-1判定:正常的黏膜上皮細胞或腫瘤細胞胞質及細胞間質出現棕黃色顆粒為陽性，陽性表達判斷標準:①低倍鏡下選染色均勻的腫瘤區域，在400倍視野下，按著色細胞占視野細胞總數的百分數分為3級:無著色細胞為0級(0分);著色細胞數＜25%為1級(1分);25% ～56%為2級(2分);＞56%為3級(3分)。②按細胞著色強弱分級:0級(0分):不著色;1級(1分):著色弱;2級(2分):中等著色;3級(3分):著色強。根據上兩項分數之和判斷:0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為中度陽性，5～6分為強陽性。

TUNEL判定:細胞核內有棕黃色或棕黑色者為凋亡細胞，凋亡程度以凋亡指數(AI)表示。隨機取5個高倍鏡視野，每個視野計數200個細胞，計算陽性細胞百分率(%)，AI=陽性細胞數/觀察細胞數×100%。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件包進行統計學分析，實驗數據用均數±標準差表示，多組均數間的比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結果

2.1 CTX對腫瘤體積生長的抑制作用

用藥前期，各組腫瘤體積未見明顯差異;隨作用時間延長，各組腫瘤體積逐漸出現差異，B組瘤體積增長速度明顯慢于D組。用藥后期，各用藥組瘤體積增長速度均慢于D組，B組腫瘤體積增長平緩，D組腫瘤生長曲線陡直，低劑量節律化療組與最大耐受量組間瘤體積無明顯差異(表1，圖1)。用藥第14天D組與各用藥組間比較，有統計學差異(P＜0.05);第21天B組腫瘤體積小于A、C兩組(P＜0.05)。

表1 各組裸鼠用藥后1、7、14、21 d移植瘤體積

圖1 各組裸鼠用藥期間移植瘤生長曲線圖

2.2 瘤重與抑瘤率

結果顯示，各用藥組與D組比較均有統計學意義，B組與A組和C組比較，有統計學差異(P＜0.05)，B組瘤質量最小，抑瘤率達69.15%，A組與C組抑瘤率比較無統計學差異(表2)。

表2 治療后各組瘤質量及抑瘤率情況(s，%)

表2 治療后各組瘤質量及抑瘤率情況(s，%)

組別 瘤質量(g)抑瘤率 P值A 組 0.76 ± 0.26 32.95 PAB=0.010，PAC =0.472 B 組 0.35 ± 0.03 69.15 PAD=0.013，PBC=0.041 C 組 0.66 ± 0.19 41.57 PBD=0.000，PCD=0.003 D 組 1.13 ±0.24—

2.3 毒副作用

化療給機體帶來的不良反應主要表現為骨髓抑制、嘔吐、腹瀉等，其中以Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制為主要的、最常見的不良反應。小鼠用藥前后一般狀況良好，各組間白細胞計數無統計學意義，MTD用藥后細胞數量呈現出上下浮動趨勢(圖2)，但均在正常值范圍內(小鼠白細胞參考值為4～12×109個/L)?？紤]可能由于傳統最大耐受量的化療方式，大量殺滅了正常白細胞，刺激了機體的自身保護機制，動員骨髓中的未成熟的白細胞進入外周血中。

圖2 小鼠用藥前后白細胞變化情況

2.4 病理檢測結果

2.4.1 MVD結果 本實驗結果顯示，D組MVD陽性表達水平明顯高于各用藥組(表3)。C組MVD表達水平高于A組和B組(P＜0.05)，而A組與B組比較、C組與D組比較均無差異(P＞0.05)。

表3 治療后各組裸鼠移植瘤MVD檢測結果(s)

表3 治療后各組裸鼠移植瘤MVD檢測結果(s)

組別 n(只)MVD數值(個)P值A 組 5 12.57 ±2.81 PAB=0.525，PAC =0.015 B 組 5 10.67 ±2.25 PAD=0.001，PBC=0.012 C 組 PBD=0.001，PCD=0.208 D組

2.4.2 TSP-1結果 本實驗結果顯示，B組 TSP-1陽性表達水平明顯高于 C、D兩組(P＜0.05)(表4)，A組其表達水平高于C、D兩組(P＜0.05)，A組與B組比較未見差異(P＞0.05)。

表4 治療后各組裸鼠移植瘤TSP-1檢測結果(s)

表4 治療后各組裸鼠移植瘤TSP-1檢測結果(s)

組別 n(只)TSP－1分值 P值A 組 5 3.40 ±0.14 PAB=0.548，PAC =0.021 B 組 5 3.71 ±0.76 PAD=0.004，PBC=0.004 C 組 PBD=0.001，PCD=0.48 D組

2.4.3 TUNEL結果 本實驗結果顯示，B組鏡下凋亡細胞數目，顯著多于其他用藥組和D組，D組與其他組間比較，AI值均存在差異，AI值B組與A、C組比較均有統計學意義(P＜0.05)，但C組與A組比較未見差異(P ＞0.05)(表5)。

表5 治療后各組裸鼠移植瘤凋亡指數(AI)(s，%)

表5 治療后各組裸鼠移植瘤凋亡指數(AI)(s，%)

A 組 5 6.80 ±0.53 PAB=0.004，PAC =0.666 B 組 5 10.30 ±1.02 PAD=0.030，PBC=0.013 C 組 5 7.30 ±0.50 PBD=0.000，PCD=0.011 D組

2.5 TSP-1、MVD、TUNEL 相關性

統計學結果顯示，裸鼠移植瘤中MVD與TSP-1表達呈負相關性(γ = －0.503，P=0.014)，TSP-1 表達與腫瘤細胞凋亡呈正相關性(γ =0.420，P=0.046)。

3 討論

惡性腫瘤的生長、轉移依賴于腫瘤血管的生成。Hanahan［2］2011年重訴了腫瘤細胞的10個基本特征，其中基因組不穩定和突變、持續的血管生成及回避凋亡均為腫瘤細胞的重要特征。傳統的化療方式主要是以細胞毒性理論為基礎，腫瘤細胞的不穩定性，易于突變，很容易使腫瘤細胞產生耐藥性。相對而言，腫瘤血管內皮細胞比較穩定，不易發生突變導致耐藥，因而抗血管生成成為治療乳腺癌的新手段。最大耐受劑量的CTX(MTD)能誘導腫瘤微血管內皮細胞凋亡，但化療周期之間的較長間歇能使大部分受損的血管系統得以恢復，因而不能帶來持久的治療效果［3］。本實驗采用了最大耐受劑量的CTX能誘導腫瘤微血管內皮細胞凋亡的優點，摒棄化療周期較長間歇使大部分受損的血管系統得以恢復的缺點，考慮到小劑量節律化療對機體的不良反應較低，且能夠持續治療較長時間，故在傳統的最大耐受劑量間歇期給與小劑量節律化療，在很大程度上增強了殺滅腫瘤細胞和抗血管生成的雙重作用。

環磷酰胺作為經典的化療藥物，屬雙功能烷化劑及細胞周期非特異性藥物，其主要干擾DNA及RNA功能，抑制腫瘤細胞增殖。傳統的化療方案主要是通過抑制腫瘤細胞生長或誘導其凋亡而發揮作用的，而節律化療雖對腫瘤細胞也有作用，但主要是通過破壞腫瘤血管而達到抗腫瘤的作用，而TSP-1可能是低劑量環磷酰胺抗腫瘤作用的潛在因子［4，5］，Hamano 等［6］和Samantha等［7］研究又提出，TSP-1誘導內皮細胞凋亡可產生抗血管生成的作用。乳腺癌經典的化療方案中(如CAF、CEF、AC-T等)均使用環磷酰胺作為基礎藥物，故本實驗采用環磷酰胺為治療藥物，將傳統的最大耐受量的化療方案與低劑量節律化療相結合，免疫組化結果證實其上調TSP-1，抑制MVD表達，提高腫瘤細胞凋亡率。因而，我們得出結論，環磷酰胺MTD聯合LDM可抗腫瘤血管生成、誘導腫瘤細胞凋亡，并不增強毒副作用;其可能通過上調TSP-1表達，間接達到抑制腫瘤血管生成。

［1］Weidner N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density with in breast carcinoma and other solid tumors〔J〕.Breast Cancer Res Treat，1995，36(2):169.

［2］Hanahan D，Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation〔J〕.Cell，2011，144(5):646.

［3］Man S，Bocci G，Francia G.Antitumor effects in mice of lowdose cyclophosphamide administered continuously through the drinking water〔J〕.Cancer Res，2002，62(10):2731.

［4］Bocci G，Francia G，Man S.Thrombospondin-1，amediator of the antiangiogenic effects of low-dose metronomic chemotherapy〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2003，100(22):12917.

［5］王 云，梁憲斌，紀媛媛，等.環磷酰胺節律化療的抗血管生成作用探討〔J〕.山東醫藥，2006，46(6):17.

［6］Hamano Y，Sugimoto H，Soubasakos MA，et al.Thrombospondin-1 associated with tumor microenvironment contributes to low-dose cyclophosphamide-mediated endothelial cell apoptosis and tumor growth suppression〔J〕.Cancer Res，2004，64(5):1570.

［7］Samantha AG，Christopher RH，Stephen GH，et al.Thrombospond-1 inhibits angiogenesis and promotes follicular atresia in a novel in vitro angiogenesis assay〔J〕.Endocrinology，2010，151(3):1280.