復合酶水解鰱魚蛋白體系動力學模型探討

王秀霞，王金，徐國念，萬端極，*

（1.青島農業大學 化學與藥學院，山東 青島 266109；2.湖北工業大學膜技術研究所，湖北 武漢 430068）

正如許多研究[1-3]認為，水解度是影響肽質量和產量的重要因素，水解度控制著肽段大小、游離氨基酸的相對含量。肽段過長，則具有生理活性的氨基酸殘基未能斷裂，就無法顯現出相應的活性；水解過于完全，肽鏈進一步水解為游離氨基酸，則一些具有活性的短肽也被水解，從而導致活性明顯降低。文獻報道[4-5]，具有生物活性的肽段不僅與活性氨基酸的含量有關，還與氨基酸組成與序列有關，通常認為，具有活性的小分子肽比組成他們的游離氨基酸活性更高，因此在合適的水解時間終止酶解反應來控制水解度是非常有必要的。

目前對蛋白質酶解的動力學研究國內外均有報道，如Tello[6]研究了Protease660L、Alealase0.6L和PEM 2500s 3種酶水解乳清蛋白的動力學模型；Marquez[7]研究了以血紅蛋白為底物的堿性蛋白酶催化水解的動力學模型；鄧尚貴[8]等探討了復合酶水解青鱗魚水解動力學模型。本研究以產量最大且價格低廉的淡水白鱗魚蛋白為酶解底物，采用Alcalase、Protamex雙酶水解，在前人總結公式上進行水解度動力學模型探討，驗證了鰱魚蛋白復合水解體系水解度模型參數，期望通過控制酶解過程來獲得較強、較純的生物活性肽，簡化工業生產操作過程，降低后續分離純化成本，為低值魚深加工探索方向。

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

氫氧化鈉、Alcalase、Protamex：購于諾維信；白鰱魚：市場購買，去頭，攪碎。

1.2 主要儀器與設備

絞肉機：鎮江市京口區食品機械廠；FA2000N型分析天平：上海名橋精密科學儀器有限公司；數顯pH計：杭州奧立龍儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋：上海嘉程儀器設備廠。

1.3 方法

用Alcalase、Protamex雙酶水解鰱魚蛋白，通過單因素確定最佳酶解條件為：溫度55℃，pH7.5，底物質量分數w（底物蛋白）=4.5%，水解180 min。以復合酶用量分別為底物蛋白質量分數，即w（酶量）為:0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%加入水解體系，在反應過程中加入2 mol/L的NaOH溶液維持pH恒定，記錄各個時間堿液用量，計算水解度（DH）。

水解度（DH）計算—pH-Stat法[9]

水解度定義為已水解的肽鍵數與原料中總肽鍵數的比值。

式中：B為堿液的體積，L；Nb為所用堿的濃度，mol/L；Mp為底物蛋白總量，g；α為氨基解離度，htot為原料中總肽鍵數，對于魚蛋白htot=8.6 mmol/g[10]。其中氨基解離度的計算公式如下：

其中pH為酶解時pH，pKa的計算公式如下[11]：

T為水解時的開爾文溫度。

2 結果與分析

根據前人[7]的研究有：

食物蛋白酶解均符合該公式。由公式（4）可以看出，水解度是一個關于反應時間的函數。對公式積分得：

式中：t為水解時間，min，此公式適用于所以蛋白質水解體系，對于不同的反應體系a、b值不同，而對于同一反應體系，a、b為常數。本研究以前面的試驗條件來驗證此動力學模型，結果如圖1。

從圖1中可以看出，各酶/底物蛋白質量分數下，水解度似乎與時間呈現某種非線性函數關系，為了驗證公式（5）是否符合試驗結果，以公式（5）為函數，分別對以上6組數據進行非線性對數擬合，擬合效果圖見圖2（a-f）。

從圖2各個圖的擬合結果可以看出，各加酶量下鰱魚蛋白酶解體系的水解度實測值與公式（5）模型擬合的結果相當吻合，6個圖均顯著相關，因此可以認為鰱魚蛋白雙酶水解體系符合對數模型，即說明前面所建立的動力學模型既具有理論意義又有實際應用價值。為了確定公式（5）中a，b值分別代表什么，我們將上面6個對數擬合而計算出的a，b列于表1。

圖1 不同酶質量分數的水解圖Fig.1 Hydrolysis curves for different initial enzyme weight percentage

圖2 不同酶／底物蛋白質量分數對數擬合圖Fig.2 Logarithm curves fit of different initial enzyme weight percentage

表1 不同酶濃度水解動力學參數a與b值Table 1 The parameter a，b of enzyme kinetics of different concentration of enzyme

從表1的數據可以看出，b值各酶量下數值較接近，并不隨酶量的改變而呈現某一規律變化，而a值則明顯的隨著酶量的增加而變大。

將加酶量與底物蛋白質量分數換算成加酶量與蛋白質量比值，結合表1可以得出結論，b值與加酶量無關，對于這一鰱魚蛋白反應體系：復合酶Alcalase+Protamex，水解溫度55 ℃，pH7.5，b值為常數，平均值為0.2351；將6個a值抽提出來，以e/s（%）為橫坐標，a為縱坐標作圖，并進行線性擬合，結果見圖3。

圖3 不同蛋白質量分數對數擬合圖Fig.3 Logarithm curves fit of different protein concentrations

由圖3可看出，a值與酶量/底物蛋白質量分數呈現顯著的線性相關性，其線性關系式為：y=1.13415x-0.33791，即a值與e/s的關系式為：a=1.13415e/s-0.33791，b=0.2351，即水解度

為了驗證水解度動力學模型實際指導意義，以e/s（%）為1.8、2.4，相同酶解溫度和pH條件下試驗，對比DH模型計算結果與實測值，結果見圖4。

圖4 實測水解度與理論水解度比較Fig.4 Comparison of experimental DH and calculated DH

由此可以認為：所建立的動力學模型具有實際指導價值，根據試驗結果推導的鰱魚蛋白復合酶水解體系的模型參數也是可信的。這對于工業生產實際操作具有指導意義，不用繁瑣的記錄加堿量來計算水解度，只要復合酶種類、底物濃度和溫度不變，即可通過控制加酶量和水解時間來控制水解度以獲得目標產物。

3 結論

在恒定水解溫度與pH值條件下，通過試驗驗證，確定Alcalase、Protamex復合酶水解鰱魚蛋白體系水解過程遵循DH=1/bln（1＋abt）這一動力學模型，經過數據擬合推算出模型參數a=1.134 e/s-0.3379，b=0.2351。驗證試驗表明，理論計算水解度與試驗所測水解度基本吻合。

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