桑椹總多酚的提取工藝研究

李巨秀，張朝紅，房紅娟，魏江華

（西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

桑椹（Mublberry），又稱桑棗、桑果，為桑科桑屬植物桑（Morass alba L.）的成熟聚花果[1-3]。桑椹中含有豐富的多酚類化合物，主要是矢車菊-3-葡萄糖苷和矢車菊-3-蕓香苷為主的花青素類[4-5]。而花色苷不僅可作為食品天然著色劑，也是一種重要的抗氧化劑，具有顯著的自由基清除能力，抑制脂質過氧化（Lipid Peroxidation）和低密度脂蛋白氧化（LDL Oxidation），降低細胞中活性氧的水平，具有預防和治療一些慢性流行病（chronic diseases）的生理功能，如癌癥、神經退化性疾病、炎癥以及心血管疾病[6-10]。

乙醇由于其成本低、毒性小、易回收等特點，成為提取多酚化合物最常用的試劑[11]。本試驗以桑椹果為試驗材料，以乙醇溶液為提取劑，通過單因素試驗和正交試驗，分別研究乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度、提取pH對桑椹總多酚得率的影響，為桑椹資源的開發(fā)以及桑椹產品功能特性的評價奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 材料

桑椹：由西北農林科技大學蠶桑絲綢研究所提供。2009年5月采摘，將剛采摘的成熟鮮桑椹，用清水洗凈后在自然陰涼處瀝干水分，每2 kg分裝在一袋，在袋中放入一包冷凍劑，存入-40℃冰箱中，備用。

1.1.2 主要試劑

Folin試劑：上海喜潤化學工業(yè)有限公司；沒食子酸：科邦生物有限公司；無水碳酸鈉、無水乙醇、鹽酸：均為分析純。

1.2 主要儀器與設備

UV-1240紫外分光光度計：日本島津公司；BFM-GBI貝利粉碎機：濟南貝利粉技術工程有限公司；KDC-40低速離心機：科大創(chuàng)新股份中佳分公司；R-200旋轉蒸發(fā)儀：瑞士步琪公司；HH-S6電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑椹總多酚的分析方法

用福林酚法測定桑椹多酚類化合物含量。

1.3.1.1 標準曲線的制作

用10mL蒸餾水溶解0.05g沒食子酸，定容至500mL，分別移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL到100 mL容量瓶中，各加入50 mL蒸餾水，加入福林酚試劑1 mL后搖勻，靜置4 min～5 min，加入15% 的Na2CO3溶液2 mL，用蒸餾水定容，置于25℃的恒溫水浴鍋中60 min反應。將反應顯色后的樣品溶液，置于分光光度計波長為760 nm下測定吸光光度值。以吸光度值為縱坐標，以沒食子酸濃度為橫坐標繪制曲線。所得到的線性方程為y=0.0811x，R2=0.9986，y為吸光度，x為沒食子酸濃度（μg/mL）。

1.3.1.2 樣品測定

取提取的桑椹樣品1 mL加入到100 mL容量瓶中，加入50 mL蒸餾水振蕩搖勻，加入Folin酚試劑1 mL搖勻，靜置約4 min～5 min，加入15% 的Na2CO3溶液2 mL，混勻后用蒸餾水定容至刻度，置于25℃的恒溫水浴中反應60 min，在760 nm波長下測定吸光度，在標準曲線上查出所對應的多酚含量，然后根據公式（1）計算桑椹多酚的得率。

式中：M為桑椹多酚的得率；μg/g，A為吸光度；N為稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.3.2 桑椹總多酚提取的單因素試驗

以桑椹總多酚得率為評價指標，分別對乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度、提取pH進行單因素試驗，以確定各因素對桑椹總多酚提取效果的影響和適宜的范圍。所有處理均進行3次重復試驗。

1.3.3 桑椹中總多酚提取的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以提取濃度（A）、提取料液比（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）、提取酸度（E）為影響因素，以桑椹總多酚得率為指標，選用L16（45）正交試驗設計表，優(yōu)化提取工藝參數，做兩次重復試驗。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L16（45）orthogonal experiment

2 結果與分析

2.1 桑椹多酚提取單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對桑椹多酚提取的影響

取桑椹樣品2 g，按料液比為1：10（g/mL）比例分別加入pH為5的0%、20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液后迅速密封，在60℃恒溫水浴中提取1 h。提取結束后用紗布進行粗過濾，然后將粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全轉入100 mL容量瓶，定容后測定，結果見圖1。

圖1 乙醇濃度對桑椹多酚提取的影響Fig.1 Influences of ethanol concentration on yield of total polyphenols from mulberry

從圖1中可以看出，隨著乙醇濃度增大，提取的桑椹多酚得率隨之增大。在乙醇濃度為60%時，總多酚得率達到最大值，而隨著乙醇濃度進一步增大，多酚得率開始下降，下降到一定值后，在乙醇濃度為80%時，趨于平緩，得率變化減小。故選取乙醇濃度為60%作為進一步試驗的總多酚提取劑。

2.1.2 料液比對桑椹多酚提取的影響

取桑椹樣品2 g，分別取料液比（g/mL）為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，以pH為5的60%乙醇溶液為提取溶劑，密封后在60℃的恒溫水浴中提取1 h。提取結束后將提取液用紗布粗過濾，再將粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全傾入100 mL容量瓶，定容后測定，分析結果見圖2。

從圖2中可以看出，當隨著料液比（g/mL）比例增大時，桑椹總多酚得率隨之增大。在料液比（g/mL）為1∶15時，桑椹多酚得率達到最大值，而隨著料液比（g/mL）比例逐步增大時，得率開始下降，當從料液比（g/mL）為1∶20至1∶30之間時，總多酚得率變化較小。所以選取提取料液（g/mL）比為1∶15時較適宜。

圖2 料液比對桑椹總多酚得率的影響Fig.2 Influences of ratio of mulberry to ethanol on yield oftotal polyphenols from mulberry

2.1.3 提取時間對桑椹多酚提取的影響

取桑椹樣品2 g，按料液比（g/mL）1∶10比例加入pH為5的60%乙醇，在60℃的恒溫水浴分別提取30、60、90、120、150、180、210 min，結束后將提取液用紗布粗過濾，粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全傾入100 mL容量瓶，定容后測定，結果見圖3。

圖3 提取時間對桑椹多酚提取的影響Fig.3 Influences of extraction time on yield of total polyphenols from mulberry

從圖3中可以看出，當提取時間增大時，總多酚得率沒有顯著變化。當提取時間達到120 min時，桑椹多酚得率值達到最大。隨著提取時間的延長，總多酚得率有所下降。若提取時間過長，不僅雜質溶出較多，同時使得多酚化合物長時間受熱分解損失，因此確定提取時間為120 min較為適宜。

2.1.4 提取溫度對桑椹多酚提取的影響

取桑椹樣品2 g，按料液比（g/mL）1∶10比例加入pH為5的60%乙醇溶液，分別在溫度為20、30、40、50、60、70、80℃提取1 h。提取結束后提取液用紗布粗過濾，粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全傾入100 mL容量瓶，定容后測定，結果見圖4。

從圖4中可以看出，隨著提取溫度升高時，總多酚得率迅速上升。在提取溫度為60℃時，桑椹總多酚得率達到最大，若提取溫度增高，多酚得率又開始迅速下降，這可能與多酚化合物的熱不穩(wěn)定性有關，因此選定提取溫度為60℃為宜。

2.1.5 提取pH對桑椹多酚提取的影響

圖4 提取溫度對桑椹多酚提取的影響Fig.4 Influences of temperature on filed of total polyphenols from mulberry

取桑椹樣品2 g，按料液比（g/mL）為1∶10比例加入不同pH的60%乙醇，pH分別為2、3、4、5、6、7，在60 ℃的恒溫水浴中提取1 h。提取結束后提取液用紗布粗過濾，粗濾液在3000 r/min下離心10 min，將上清液完全傾入100 mL容量瓶，定容后測定，結果見圖5。

圖5 提取pH對桑椹多酚提取的影響Fig.5 Influences of pH value on field of total polyphenols from mulberry

從圖5中可以看出，當隨著提取酸度減小即pH增大時，桑椹總多酚得率隨之增大，并且在提取溶劑pH為4時，得率達到最大值。而隨著提取溶劑pH增大，提取量值又開始迅速下降。故溶劑的pH為4時提取效果較好。由于在中性及堿性pH下都會破壞多酚化合物的結構，導致其損失。因此，一般在酸性條件下可以保護多酚化合物，從而提高提取得率。

2.2 桑椹多酚提取工藝的優(yōu)化

在以上單因素試驗的基礎上，以桑椹總多酚得率為指標，采用五因素四水平正交試驗方案對提取工藝參數進行優(yōu)化，考察乙醇濃度、提取料液比、提取時間、提取溫度以及提取溶劑pH桑椹總多酚得率的影響。正交試驗設計及結果見表2。方差分析結果見表3。

由極差分析可以看出（表2），5個因素對多酚提取效果影響的主次順序為：A>C>D>B>E，即提取溶劑濃度>提取時間>提取溫度>提取料液比>提取pH。試驗所得最佳優(yōu)化工藝組合為A3B3C3D4E2，即乙醇為65%、料液比1∶15（g/mL）、提取時間120 min、提取溫度65 ℃、提取為pH為4。

從表3方差分析可知，乙醇濃度和提取時間對桑椹總多酚得率在α=0.01水平上有極顯著的影響，料液比、提取溫度和pH在α=0.05水平上對桑椹總多酚得率均有顯著的影響。

表2 桑椹總多酚的提取正交試驗方案及結果Table 2 Results of the orthogonal experiment of extraction total polyphenol from mulberry

表3 正交設計方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

由于得到的優(yōu)化組合不在正交試驗組合中，對優(yōu)化組合進行了2次重復驗證試驗，經分析，桑椹總多酚得率為6709μg/g，說明該工藝可行。

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用正交試驗設計對其桑椹總多酚提取工藝進行優(yōu)化，得到優(yōu)化的提取工藝參數為：乙醇濃度為65%、料液比為1∶15（g/mL）、提取時間為120 min、提取溫度為65℃、提取的pH為4。在此條件下總多酚的提取含量是6709μg/g。

通過極差分析和方差分析，影響桑椹總多酚提取效果的因素主次順序為提取溶劑濃度>提取時間>提取溫度>提取料液比>提取酸度，并且乙醇濃度和提取時間在0.01水平上對桑椹總多酚的提取有極顯著的影響，料液比、提取溫度和pH在0.05水平上對桑椹總多酚的提取有極顯著的影響。

[1]丁杰.AB-8型大孔樹脂對桑葚紅色素的分離純化研究[J].安徽農學通報，2009，15(15)：216-218

[2]王傳榮.桑葚保健鮮啤酒的開發(fā)與研究[J].中國釀造，2008(13)：88-90

[3]褚彥如.桑椹紅色素分析及穩(wěn)定性研究[D].北京：中國農業(yè)大學，2007

[4]Neuza M A H,Maria I G,Franco M L.Absorption and metabolism of cyanidin-3-glucoside and cyanidin-3-rutinoside extracted from wild mulberry(Morus nigra L.)in rats[J].Nutrition research,2008(28):198-207

[5]SONG-HWAN B,HYONG-JOO S.Antioxidant Activities of Five Different Mulberry Cultivars in Korea[J].LWT-Food Science and Technology,2007，40(28):955-962

[6]常徽，糜漫天，凌文華.黑米花色苷及聯(lián)合化療藥物對不同腫瘤細胞增殖的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報，2007，29(20)：1943-1946

[7]張玉梅，唐志紅，夏敏，等.花色苷對ApoE基因缺陷小鼠炎癥信號轉導的影響[J].營養(yǎng)學報，2005，27(3)：249-252

[8]陳美珺，梁統(tǒng)，周克元.原花青素對脂多糖誘導的RAW264.7細胞NF-КB DNA結合活性的抑制作用[J].廣東醫(yī)學院學報，2005,23(2)：115-118

[9]易龍，陳春燁，金鑫，等.花色苷類植物化學物抑制血管內皮細胞氧化應激損傷作用的結構-效應關系研究 [J].第三軍醫(yī)大學學報，2009，31(21)：2046-2049

[10]常徽,糜漫天,顧艷艷，等.黑米花色苷對白血病細胞株HL-60及正常淋巴細胞活性氧及線粒體膜電位的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報，2008，30(7)：585-587

[11]郝少莉，仇農學，王宏.蘋果渣中多酚物質的提取技術研究[J].西北農業(yè)學報，2006，15(2):152-155