HPLC測(cè)定不同方法提取的山黧豆中β-ODAP

趙興秀，何義國(guó)，鄧靜，方春玉，孟延發(fā)

（1.四川理工學(xué)院 生物工程系，四川 自貢 643000；2.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064）

山黧豆（Lathyrus sativus L.）屬豆科蝶形花亞科山黧豆屬一年生作物，在全世界有廣泛的種植，是人畜都可食用的豆科植物。其對(duì)環(huán)境具有廣泛的適應(yīng)性：耐寒、耐旱、抗蟲害，尤其在干旱年份，在其他豆類及谷物都絕收時(shí)，它仍能維持一定的產(chǎn)量，是適合于干旱、半干旱地區(qū)種植的作物。山黧豆?fàn)I養(yǎng)豐富，種子中蛋白質(zhì)含量高達(dá)25%～28%，近似于小麥2倍，淀粉含量為55%～61%。而且蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物含有哺乳動(dòng)物所需的17種主要的α-氨基酸[1]，所以是比較理想的高蛋白豆科飼料作物。但山黧豆籽實(shí)內(nèi)含有一種非蛋白質(zhì)氨基酸β-N-草酰基-α，β－二氨基丙酸（β－N－oxalyl－α，β－diaminopropionic，簡(jiǎn)稱β-ODAP），是一種主要的毒素[2-3]，長(zhǎng)期食用可引起下肢癱瘓，稱為山黧豆中毒，從而妨礙了山黧豆的推廣和種植。更進(jìn)一步的研究顯示，山黧豆中還存在著β－ODAP的另一種異構(gòu)體，α－N－草酰 基 －α，β － 二 氨 基 丙 酸 （α －N －oxalyl－α，β －diaminopropionic，簡(jiǎn)稱α-ODAP），其中β-ODAP有毒性，α-ODAP無(wú)毒性或者毒性較弱，在水溶液中加熱可使這兩種異構(gòu)體互相轉(zhuǎn)化[4]。

為了充分利用這一耐旱作物的高營(yíng)養(yǎng),國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在β-ODAP的分離鑒定、化學(xué)及生物合成、分析方法、毒理學(xué)及代謝機(jī)理等方面做了大量工作[5]。這些工作都涉及到大量樣品中β-ODAP和無(wú)毒的α-ODAP的分析測(cè)定。因此，研究和建立快速、方便、準(zhǔn)確的提取和分析方法非常必要。目前，對(duì)β-ODAP的測(cè)定方法已有不少報(bào)道[5]。如用6-氨基喹啉-N-羥丁二酰亞胺氨基甲酸酯（AQC）[6]、異硫氰酸苯酯（PITC）[7]、9－芴基甲基氯甲酸酯（FMOC）[8]等試劑柱前衍生液相色譜（HPLC）法。這些方法都采用梯度洗脫，或異構(gòu)體夾雜在樣品中其它氨基酸色譜峰之間,分析時(shí)間長(zhǎng)，或不能區(qū)分α和β-ODAP的異構(gòu)體。Wang等[9]提出2，4-二硝基氟苯（DNFB）試劑柱前衍生的HPLC法可使α，β－ODAP最先出峰。用高氯酸提取法、乙醇提取法和水提取法進(jìn)行樣品的預(yù)處理，采用恒組分進(jìn)行洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高氯酸提取法使樣品的分析時(shí)間大大縮短,這將有利于大量樣品的分析。同時(shí)，還研究了3種不同提取方法對(duì)ODAP含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

山黧豆：購(gòu)自甘肅；α，β-ODAP標(biāo)樣：由蘭州大學(xué)應(yīng)用有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；衍生化試劑DNFB：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙腈為色譜純。實(shí)驗(yàn)中其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)溶液用Molli-Q水配制。高效液相色譜儀（LC-6AD）：島津 LC-6AD泵（2臺(tái)），柱溫箱為CTO-10AS，檢測(cè)器為SPD-M20A，系統(tǒng)控制器為CBM-20A。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

采用水提取法、30%乙醇提取法和0.2 mol/L高氯酸提取法。各法均準(zhǔn)確稱量600 mg山黧豆粉，分別加入5 mL水、30%乙醇和0.2 mol/L高氯酸中，水提取法于60℃浸取24 h，30%乙醇提取法于室溫浸取24 h，高氯酸提取法于0℃～4℃浸取1 h，然后離心（12000 r/min），取上清液，保存于4℃。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品衍生化和預(yù)處理

取不同質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶解于100 μL的NaHCO3溶液（0.5 mol/L）中，配成梯度溶液，然后加入100 μL DNFB乙腈溶液（1 μL DNFB溶解于100 μL乙腈中）。在60℃水浴中避光反應(yīng)30 min后，冷卻至室溫，然后加入800 μL KH2PO4溶液（0.01 mol/L），搖勻后用0.45 μm膜過(guò)濾，然后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.3 樣品衍生化和預(yù)處理

水提取液和乙醇提取液的衍生均為：分別取100μL水提取和乙醇提取的上清液加入100 μL的NaHCO3溶液（0.5 mol/L），再加入50 μL蒸餾水，然后加入100 μL DNFB乙腈溶液（1 μL DNFB溶解于100 μL乙腈中）。在60℃水浴中避光反應(yīng)30 min后，冷卻至室溫，然后加入650 μL KH2PO4溶液（0.01 mol/L），搖勻并用0.45 μm膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為20 μL。

高氯酸提取液的衍生為：100 μL上清液加入150 μL的NaHCO3溶液,然后加入100 μL DNFB乙腈溶液。在60℃水浴中避光反應(yīng)30 min后，冷卻至室溫，然后加入650 μL KH2PO4溶液，搖勻并用0.45 μm膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：C18，250 mm×46 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈/溶液A（17∶83，體積比，溶液A是 K2HPO4∶二甲基甲酰胺∶水為0.03 mol∶10 mL∶990 mL的溶液，并用冰醋酸調(diào)pH為5.5）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；溫度：28℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[9-10]，選擇DNFB的量是ODAP的3倍以及60℃水浴中避光反應(yīng)30 min為最佳衍生條件。衍生后的產(chǎn)物比較穩(wěn)定，可在室溫放置一周或者4℃放置3個(gè)月，α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB的峰面積都不會(huì)發(fā)生改變，但是DNB-OH的面積會(huì)增加，分析認(rèn)為這是由于DNFB水解引起的。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相pH對(duì)分離效果的影響

流動(dòng)相pH對(duì)分離效果的影響見圖1。

圖1 pH對(duì)β-ODAP-DNB和α-ODAP-DNB保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of pH on retention time of β-ODAP-DNB and α-ODAP-DNB

如圖1所示，pH對(duì)α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB分離影響不大，但是當(dāng)pH低于4時(shí)，發(fā)現(xiàn)α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB的峰變得很寬而且拖尾現(xiàn)象很嚴(yán)重，當(dāng)pH在4～5.5范圍內(nèi)，α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB分離效果較好，而且峰形很好，無(wú)拖尾現(xiàn)象。

2.2.2 乙腈含量對(duì)分離效果的影響

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：如果乙腈含量太高，α-ODAPDNB和β-ODAP-DNB分不開；乙腈含量太低，出峰較晚。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，乙腈含量為17%分離效果最好。

2.2.3 柱溫對(duì)分離效果的影響

柱溫對(duì)色譜峰的分離和拖尾均有一定的影響。實(shí)驗(yàn)得：柱溫太高，α-ODAP-DNB和β-ODAP-DNB分不開，柱溫太低，峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；當(dāng)柱溫為28℃時(shí)，既無(wú)拖尾，又能將兩者分開。

所以，在標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC檢測(cè)中，均將最佳色譜條件確定為：pH為5.5，柱溫為28℃，流動(dòng)相為乙腈/溶液A（17∶83，體積比）。

2.3 樣品檢測(cè)

在最佳色譜條件下，經(jīng)過(guò)上樣檢測(cè)，得到ODAP標(biāo)準(zhǔn)品、高氯酸提取液、乙醇提取液和水提取液的色譜圖（圖2～圖5），再用ODAP兩個(gè)異構(gòu)體的濃度與色譜面積（×107）回歸得到工作曲線方程（表1）。

圖2 ODAP標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of ODAP standard derivatized with FDNB

圖3 高氯酸提取山黧豆樣品色譜圖Fig.3 Typical chromatogram of the sample from Lathyrus sativus by the method of perchloric acid extraction

圖4 乙醇提取山黧豆樣品色譜圖Fig.4 Typical chromatogram of the sample from Lathyrus sativus by the method of aqueous ethanol extraction

圖5 水提取山黧豆樣品色譜圖Fig.5 Typical chromatogram of the sample from Lathyrus sativus by the method of water extraction

表1 α，β－ODAP的工作曲線Table 1 Calibration curve date of α，β－ODAP

從表1可以看出，兩個(gè)回歸方程的相關(guān)系數(shù)分別為以0.9784和0.9818，說(shuō)明β-ODAP和α-ODAP濃度都與其峰面積具有非常好的線性關(guān)系，從而可以根據(jù)峰面積直接得出兩種化合物的濃度和含量。

根據(jù)曲線方程得到3種不同方法提取的萃取液中的β-ODAP和α-ODAP的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同方法得到的樣品提取液的分析結(jié)果Table 2 Contents of α，β－ODAP in Lathyrus sativus via three extraction methods

從表2可以看出，30%乙醇提取的β-ODAP和α-ODAP的最大量分別為0.497%和0.229%，而采用水和高氯酸提取法β-ODAP的最大量可以達(dá)到為0.528%和0.529%，α-ODAP的最大量為0.258%和0.256%。其提取效果均高于30%乙醇提法。

3 結(jié)論

水提取法和0.2 mol/L高氯酸提取法效果相當(dāng)。其中水提法得到的上清液中β-ODAP的含量為0.522%，α-ODAP的含量為0.252%；高氯酸提取法得到的上清液中β-ODAP的含量為0.523%，α-ODAP的含量為0.251%；而30%乙醇提取法不如水提法和高氯酸提取效果好，其上清液中β-ODAP的含量為0.492%，α-ODAP的含量為0.225%。但是水和乙醇提取法耗時(shí)長(zhǎng)，均需24 h。而0.2 mol/L高氯酸提取法耗時(shí)短，只需要在0℃～4℃提取1 h，這就有利于大量樣品的分析，為進(jìn)一步制備純化等研究奠定了基礎(chǔ)。

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