白靈菇菌絲體多糖兩種測(cè)定方法的比較

王守現(xiàn)，劉宇，趙爽，許峰，耿小麗，王蘭青，孟莉莉

（北京市農(nóng)林科學(xué)院 植保環(huán)保研究所，北京 100097）

白靈菇（Pleurotus eryngii var.nebrodensis）又名阿魏蘑、阿魏菇、阿魏側(cè)耳，隸屬于真菌門(mén)、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1]。白靈菇子實(shí)體潔白，風(fēng)味獨(dú)特，被譽(yù)為“草原上的牛肝菌”[2]。具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)[3]，此外還具有防癌抗癌等藥用功效，是一種天然保健食品[4]。白靈菇多糖含量的測(cè)定，有的采用苯酚-硫酸法[5]，有的采用蒽酮-硫酸法[6]。本文對(duì)白靈菇菌絲體多糖的2種測(cè)定方法進(jìn)行了比較研究，以選定一種方便快捷的適合白靈菇菌絲體多糖含量測(cè)定的方法。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

葡萄糖（分析純）：105℃恒溫烘干至恒重；95%乙醇、濃硫酸（分析純）、蒽酮（分析純）、苯酚（重蒸餾）、丙酮（分析純）、乙醚（分析純）：中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮一硫酸：當(dāng)天配制。

1.1.2 儀器

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；GHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)有限公司；SXT-06索氏提取器：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；UV-2802H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器廠；電子分析天平：瑞士梅特勒。

1.2 材料

白靈菇發(fā)酵菌絲體提取得到的多糖：取供試菌株于250 mL三角瓶液體培養(yǎng)基中25℃、130 r/min活化培養(yǎng)6 d～7 d，然后轉(zhuǎn)入500 mL三角瓶中在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3d，此時(shí)菌絲生物量最大，多糖含量高。用4層紗布過(guò)濾收集菌絲體、干燥粉碎、65℃干燥5 h～6 h至質(zhì)量不發(fā)生變化，即為脫脂前粉重。根據(jù)脫脂前粉重加50倍體積的80%乙醇在索氏提取器中90℃醇析脫脂4 h；將脫脂后的菌絲粉末在65℃烘干5 h～6 h，即為水提質(zhì)量；根據(jù)水提質(zhì)量按1/50比例加蒸餾水，水浴鍋水溫控制在95℃左右，水浸提2次（第1次3 h、第2次2 h），合并水提液，抽濾、55℃～60℃真空濃縮至1/4體積左右，加4倍體積的無(wú)水乙醇使乙醇濃度為80%左右。醇沉、過(guò)夜。去上清收集沉淀于50 mL離心管中離心，先后用丙酮、乙醚多次洗滌后離心，35℃干燥。將50 mL離心管中粗多糖粉末轉(zhuǎn)入10 mL離心管中稱(chēng)重，即得粗多糖質(zhì)量，作為此次研究的供試樣品。

1.3 方法

1.3.1 苯酚硫酸法

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL定容于10 mL容量瓶中，濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，搖勻。分別吸取2 mL于20 mL具塞試管中，另取2 mL蒸餾水作空白對(duì)照。各加6%苯酚（重熏）溶液1.0 mL，振搖混勻，加硫酸5.0 mL，迅速振搖混勻，于室溫下靜置15 min，置于100℃水浴30 min，混勻，迅速冷卻，再混勻。用紫外分光光度計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度。以葡萄糖溶液的濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對(duì)同一份多糖樣品，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0 h測(cè)定其光密度值分計(jì)算其RSD值。

3）精密度實(shí)驗(yàn)：從一種樣品中分別吸取5 mL 8份置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，吸取每份溶液2 mL，同標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。

4）回收實(shí)驗(yàn)：采用加樣回收法，取已知菌絲體多糖含量溶液4份，分別精密加入一定量葡萄糖溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線條件下測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.3.2 蒽酮-硫酸法

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL定容于10 mL容量瓶中，濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，搖勻。分別吸取2 mL于20 mL具塞試管中，另取2 mL蒸餾水作空白對(duì)照。于冰水浴中加入0.1%蒽酮試劑5mL。搖勻，于水浴中加熱50 min。冷至室溫。另取2 mL水作空白，于波長(zhǎng)625 nm處比色，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以葡萄糖溶液的濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸收度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對(duì)同一份多糖樣品，分別在0、0.5、1.0、1.5、2.0 h測(cè)定其光密度值分計(jì)算其RSD值。

3）精密度實(shí)驗(yàn)：從一種樣品中分別吸取5 mL 8份置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，吸取每份溶液2 mL，同標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。

4）回收實(shí)驗(yàn)：采用加樣回收法，取已知菌絲體多糖含量溶液4份，分別精密加入一定量葡萄糖溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線條件下測(cè)定，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

苯酚-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 苯酚-硫酸法測(cè)定不同濃度葡萄糖吸光度值Fig.1 Calbration curves of different standards with phenolsulfuric acid method of glucose

從圖1可以看出，其線性回歸方程為y=0.0135x+0.0543；相關(guān)系數(shù)R2=0.9888，葡萄糖含量在0～60μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

蒽酮-硫酸法葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 蒽酮-硫酸法測(cè)定不同濃度葡萄糖吸光度值Fig.2 Calbration curves of different standards with anthronesulfuric acid method of glucose

從圖2可以看出，其線性回歸方程為y=0.0077x+0.0208）；相關(guān)系數(shù)R2=0.9874，葡萄糖含量在0～50μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3 2種方法對(duì)白靈菇的穩(wěn)定性、精密度及回收實(shí)驗(yàn)分析

苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測(cè)定白靈菇菌絲體多糖的穩(wěn)定性、精密度及回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，表2。

表1 2種方法的穩(wěn)定性、精密度及回收實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability,precision and adding standard sample experiments by two methods

從表1可以看出，穩(wěn)定性和精密度實(shí)驗(yàn)中，苯酚-硫酸法測(cè)定白靈菇菌絲體多糖的RSD值分別為0.71%、2.10%，均小于蒽酮-硫酸法的RSD值1.40%、9.53%，說(shuō)明苯酚-硫酸法較蒽酮-硫酸法實(shí)驗(yàn)結(jié)果精密，各重復(fù)間誤差小；而在回收實(shí)驗(yàn)中，苯酚-硫酸法的RSD值為14.11%，大于蒽酮-硫酸法的RSD值3.51%，說(shuō)明蒽酮-硫酸法測(cè)得多糖不同回收率之間數(shù)值差異小，苯酚-硫酸法測(cè)得值差異大（如表2所示）。

表2 2種方法回收率試驗(yàn)Table 2 Discovery of adding standard sample experiments by two methods

從表2可以看出，蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖回收率平均值為154.88%，大于苯酚-硫酸法的回收率平均值125.41%，說(shuō)明蒽酮-硫酸法測(cè)得多糖含量較實(shí)際多糖量數(shù)值偏大，誤差大。因此，苯酚-硫酸法比較適合白靈菇菌絲體多糖含量測(cè)定。

3 結(jié)論與討論

本文采用苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法對(duì)白靈菇菌絲體多糖含量進(jìn)行了測(cè)定。苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的原理是依據(jù)糖經(jīng)濃硫酸處理后脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物，再與苯酚縮合生成橙黃色物質(zhì)于490 nm處比色，而蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖的原理是依據(jù)多糖濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，與蒽酮試劑起縮合反應(yīng)，生成藍(lán)綠色化合物，于620 nm處比色[7]。2種方法所用的顯色劑有特異性，僅與樣品中特定的物質(zhì)反應(yīng)，具有較高的靈敏度。在白靈菇菌絲多糖含量的測(cè)定中苯酚-硫酸法較蒽酮-硫酸法測(cè)定結(jié)果靈敏、誤差小、操作簡(jiǎn)便，因而苯酚-硫酸法是測(cè)定白靈菇菌絲體多糖含量較為理想的方法；但因苯酚容易氧化，見(jiàn)光或遇氧即逐漸氧化成淡紅色，因此，在測(cè)定中應(yīng)該避光且操作要迅速。在測(cè)定白靈菇菌絲體多糖的試驗(yàn)中，與苯酚-硫酸法相比，蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性和精密度較差，回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果偏高，可能是由于白靈菇菌絲體中蛋白質(zhì)[8]對(duì)蒽酮-硫酸法的顯色反應(yīng)有一定干擾所致。

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