功能因子角鯊烯胞內(nèi)抗氧化作用的研究

喬鏡澄，張同存，姜悅，路福平

（1.天津天獅學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津 301700；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300222）

基于對(duì)細(xì)胞體外受氧脅迫的抗氧化的反應(yīng)的研究，已發(fā)現(xiàn)氧自由基可以導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。其中脂質(zhì)過氧化就是氧脅迫的產(chǎn)物。然而，在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化作用的反應(yīng)機(jī)理仍不清楚[1]。

破囊壺菌的重要合成產(chǎn)物角鯊烯，角鯊烯（squalene）[2-3]：化學(xué)命名為2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22.二十四碳六烯，是一種長(zhǎng)鏈三萜類化合物，別名為鯊烯、三十碳六烯、角鮫油素或魚肝油萜，屬于不飽和脂質(zhì)，它是所有類固醇合成的前體物質(zhì)。鯊烯是天然抗氧化劑，可以保護(hù)細(xì)胞免遭自由基的損害并且可以增強(qiáng)細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。鯊烯的特殊性質(zhì)使其應(yīng)用范圍非常廣泛，這種無毒性的物質(zhì)可以直接添加到普通食品中，添加鯊烯和不飽和脂肪酸的功能性食品也在積極的研制中。

已有研究報(bào)道[4]，在細(xì)胞外部鯊烯可以防止不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)。然而，在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化作用的機(jī)制仍然不清楚。已有報(bào)道[1]雙氧水是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸過氧化反應(yīng)的主要誘導(dǎo)劑，Cumeme hydroperoxide（CHP）t-Butylhydroperoxide可以引發(fā)小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸產(chǎn)生過氧化現(xiàn)象，茉莉酸甲酯也是常用的引起脂肪酸過氧化現(xiàn)象的誘導(dǎo)劑[5]。

本研究選用上述4種常用的脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)劑作用于破囊壺菌引發(fā)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。通過測(cè)定MDA的含量反映細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，也間接反映出細(xì)胞受到ROS攻擊后的損傷程度[6]，因此在本實(shí)驗(yàn)中選用這一指標(biāo)，觀察細(xì)胞內(nèi)在外界氧脅迫下抗氧化的反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

破囊壺菌（Thraustochytrid）Aurantiochytriumsp.BRMP4-A1，香港浸會(huì)大學(xué)理學(xué)院生物系微藻研究實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基組成（1 L）[7]：MnCl28.6 mg/L，F(xiàn)eCl32.9 mg/L，ZnCl20.6 mg/L，CoCl2·6H2O 0.28 mg/L，CuSO4·5H2O 0.02 mg/L，硼酸 34.2 mg/L，Na2EDTA 30 mg/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，KCl 1 g/L，（NH4）2SO40.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.3 g/L，KH2PO40.3g/L，NaHCO31g/L，葡萄糖30g/L，NaCl 25g/L，谷氨酸鈉 2 g/L，Yeast Extract 2 g/L，蒸餾水定容至1 L。

配制好后，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為6.0，然后高壓蒸汽滅菌，滅菌條件為：121℃，20min。

1.1.3 試劑

雙氧水，t-Butyl htdroperoxid：美國(guó)sigma公司，茉莉酸甲酯：美國(guó)sigma公司，Cumeme hydroperoxide：美國(guó)sigma公司，其他試劑為化學(xué)純或分析純。

1.1.4 儀器和設(shè)備

HS-200B恒溫培養(yǎng)搖床：上海和呈儀器制造有限公司；HV-50高壓滅菌鍋：日本TOMY公司；JY98-III超聲波間歇破碎儀：寧波新芝儀器研究所；VLT1386-3-V34超低溫冰箱：美國(guó)REVCO公司；Allegra X-22臺(tái)式高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

菌種培養(yǎng)：挑取一環(huán)接種到裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，200 r/min，25℃恒溫，黑暗條件下培養(yǎng)48 h。

菌體發(fā)酵：以5%的接種量接種種子液到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，200 r/min，25℃恒溫，黑暗條件下培養(yǎng)36 h。

1.2.2 樣品中丙二醛濃度的測(cè)定

按照丙二醛測(cè)定試劑盒操作步驟進(jìn)行加樣。旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻，然后3500 r/min～4000 r/min，離心10 min，取上清在OD532nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)定樣品的吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞存活率測(cè)定方法

稀釋平板計(jì)數(shù)法：菌液混合均勻后，無菌條件下，吸取1 mL菌液，移入裝有9 mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液500 mL到無菌培養(yǎng)皿中，再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個(gè)稀釋度用一個(gè)滅菌刮鏟，將涂布好的平板平放于桌上20 min～30 min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉(zhuǎn)，室溫黑暗培養(yǎng)，至長(zhǎng)出單菌落后即可計(jì)數(shù)。

1.2.4 菌體干重測(cè)定方法

將GC-50濾紙105℃烘干，放入干燥箱中冷卻至重量恒定，稱重備用。在通風(fēng)櫥中用移液管吸取5 mL菌液，抽濾到已烘干的濾紙上，105℃烘干，隔夜，冷卻后稱其重量。根據(jù)2個(gè)重量差及菌體量計(jì)算菌體干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙氧水誘導(dǎo)的脂過氧化反應(yīng)

細(xì)胞培養(yǎng)到36 h時(shí)，加入雙氧水，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量，結(jié)果如表1所示。

表1 36 h時(shí)雙氧水對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和脂過氧化作用Table 1 Effect of H2O2on cell number and lipid peroxidation（MDA value）at 36 h

在菌體細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)0 h時(shí)，加入雙氧水，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA值，細(xì)胞干重及細(xì)胞存活率，結(jié)果如表2所示。

表2 0 h時(shí)加入雙氧水對(duì)細(xì)胞干重的影響和脂過氧化作用Table 2 Effects of H2O2on cell dry weight（DW），cell number and MDA value at 0 h

由表1、表2所示，36 h時(shí)加入脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)劑，隨著雙氧水濃度的增加MDA值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)雙氧水終濃度達(dá)到當(dāng)5000 μmol/L時(shí)，MDA值明顯低于空白對(duì)照組。同時(shí)，細(xì)胞存活率隨著雙氧水的濃度增加而降低。雙氧水濃度達(dá)到1000 μmol/L和5000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)僅為104個(gè)/mL。在細(xì)胞培養(yǎng)0 h時(shí)，加入雙氧水，MDA值仍然沒有明顯上升，只有在雙氧水濃度為500 μmol/L時(shí)，MDA值接近空白對(duì)照組。而隨著雙氧水濃度的增加，細(xì)胞干重與細(xì)胞數(shù)都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，即細(xì)胞存活率隨著雙氧水濃度的增加而降低。

2.2 t-butyl hydroperoxide誘發(fā)的脂過氧化反應(yīng)

將t-butyl hydroperoxide加入到培養(yǎng)36 h的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量，結(jié)果如表3所示。

表 3 36 h 時(shí)加入 t－butyl hydroperoxide（t－BuOOH）對(duì)細(xì)胞存活的影響和脂質(zhì)過氧化作用Table 3 Effect of t-butyl hydroperoxide（t－BuOOH）on cell viability and MDA value at 36 h

在菌體細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)0 h時(shí)，加入t-Butyl hydroperoxide，繼續(xù)培養(yǎng)至36 h，收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA值，細(xì)胞干重及細(xì)胞存活率，結(jié)果如表4所示。

表4 0 h時(shí)加入t-Butyl hydroperoxide對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和脂過氧化作用Table 4 Effects of t-Butyl hydroperoxide on cell number and lipid peroxidation（MDA value）at 0 h

由表3、表4所示，36 h時(shí)加入脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)劑MDA值沒有隨著t-Butyl hydroperoxide濃度的增加而提高，相反呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且均明顯低于空白對(duì)照組，而通過平板計(jì)數(shù)可知，高濃度的t-Butyl hydroperoxide對(duì)細(xì)胞作用較大，當(dāng)其濃度達(dá)到1000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)為零，細(xì)胞生長(zhǎng)完全被抑制。細(xì)胞培養(yǎng)0 h時(shí)，加入脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)劑，t-Butyl hydroperoxide在較高濃度下，細(xì)胞存活率很低，甚至死亡，0 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)積累量較少，因此在高濃度的t-Butyl hydroperoxide作用下，對(duì)細(xì)胞造成毒害作用，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。加入這種脂過氧化誘導(dǎo)劑后，MDA值沒有上升，均明顯低于空白對(duì)照組。

2.3 茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)的脂過氧化反應(yīng)

將茉莉酮酸甲酯加入到培養(yǎng)36 h的細(xì)胞中，進(jìn)行脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量，結(jié)果如表5所示。

表5 36 h時(shí)加入茉莉酮酸甲酯對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和脂過氧化作用Table 5 Effects of Methyl jasmonate on cell growth and MDA value at 36 h

由表5所示，在各濃度茉莉酸甲酯的作用下，MDA值都低于空白對(duì)照組，茉莉酮酸甲酯對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)并沒有抑制作用，細(xì)胞數(shù)沒有影響。

2.4 cumeme hydroperoxide（CHP）誘導(dǎo)的脂過氧化反應(yīng)

將培養(yǎng)到36 h的細(xì)胞加入CHP進(jìn)行脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量及細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如表6所示。

由表6所示，只有當(dāng)cumeme hydroperoxide濃度達(dá)到100 μmol/L 時(shí)，MDA值略高于空白對(duì)照（527.1）為562.5，在所選用的CHP的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞的生長(zhǎng)并沒有受到抑制，由此可以得出，CHP對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有毒害作用。

表6 36 h時(shí)加入cumeme hydroperoxide對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和脂質(zhì)過氧化作用Table 6 Effect of cumeme hydroperoxide on cell number and MDA value at 36 h

在菌體細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)0 h時(shí)，加入cumeme hydroperoxide，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA值，細(xì)胞干重及細(xì)胞存活率，結(jié)果如表7所示。

表7 0 h時(shí)加入cumeme hydroperoxide對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和脂過氧化作用Table 7 Effect of cumeme hydroperoxide on cell number and MDA value at 0 h

由表7所示，高濃度的CHP仍然未能誘導(dǎo)脂過氧化反應(yīng)，MDA值均明顯低于空白對(duì)照組，但是在較高濃度CHP作用下，細(xì)胞數(shù)下降，細(xì)胞存活率降低。

3 結(jié)論

本研究選用H2O2、t-Butyl hydroperoxide、茉莉酸酮甲酯和CHP 4種常用的脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)劑處理BRMP4-A1菌株細(xì)胞[8-10]，并考察細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，結(jié)果表明：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，都沒有看到MDA值的明顯升高。同時(shí)，已有研究證明[7]，該菌株在細(xì)胞培養(yǎng)至36 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)積累鯊烯量達(dá)到最大值，因此，認(rèn)為正是破囊壺菌合成的鯊烯可以保護(hù)不飽和脂肪酸發(fā)生自發(fā)氧化現(xiàn)象，它較強(qiáng)的抗氧化作用可以減少自由基的生成，而鯊烯本身清除了氧自由基，在這樣的多重作用下，強(qiáng)有力的遏制了過氧化物造成的細(xì)胞內(nèi)部的脂質(zhì)過氧化的損失，也抑制了脂質(zhì)過氧化。所以本實(shí)驗(yàn)可以看到MDA的含量均明顯低于空白對(duì)照組。當(dāng)CHP濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，MDA值高于空白對(duì)照，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的脂過氧化，而細(xì)胞存活率未受到影響，這種情況表明，很大可能是鯊烯的抗氧化性保護(hù)細(xì)胞免受自由基的侵害，減小了細(xì)胞受損傷程度，這也仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)0 h時(shí)，未出現(xiàn)MDA高于空白對(duì)照組想象，但是在高濃度的誘導(dǎo)劑作用下，細(xì)胞出現(xiàn)了死亡，這一結(jié)果表明：0 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)代謝物的積累為0，高濃度的氧化劑t-Butyl hydroperoxide在發(fā)酵初期就導(dǎo)致細(xì)胞的大量死亡，不能合成鯊烯。因此，得出t-Butyl hydroperoxide對(duì)破囊壺菌細(xì)胞有毒害作用，高濃度作用下會(huì)導(dǎo)致破囊壺菌的死亡[11]。隨著作用時(shí)間的增加，在破囊壺菌細(xì)胞內(nèi)部，鯊烯逐漸積累，低濃度的t-Butyl hydroperoxide和茉莉酮酸甲酯沒有誘導(dǎo)脂過氧化，所以脂過氧化并不是導(dǎo)致破囊壺菌細(xì)胞死亡的主要原因。細(xì)胞死亡是由于高濃度的t-Butyl hydroperoxide作用下而導(dǎo)致的。

可以確定在破囊壺菌的代謝產(chǎn)物中的確存在具有抗氧化作用的物質(zhì)，并且角鯊烯在細(xì)胞內(nèi)部已發(fā)揮作用能夠抵抗脂質(zhì)過氧化并且保護(hù)細(xì)胞免受外界侵害。

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