產木聚糖酶和纖維素酶真菌的酶學性質分析

麥國琴，許曉萍，余翠媚，張立國，王娟

（深圳大學 生命科學學院，廣東 深圳 518060）

纖維素是地球上分布最廣、蘊藏量最豐富的生物質,也是最廉價的可再生資源。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協同作用，分解纖維素產生寡糖和纖維二糖，最終水解為葡萄糖[1]。纖維素酶可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取等眾多領域，特別是在紡織、洗滌、造紙和生物能源等工業應用上具有重要地位[2]。木聚糖是植物半纖維素的主要成分，是一種多聚五碳糖，且多以異質多糖形式存在，與纖維素分子之間存在氫鍵連接和物理混合。木聚糖酶是一類降解木聚糖分子的復雜酶系，包括內切β－1，4－木聚糖酶、β－D－木糖苷酶、α－L－呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等[3]。

南海沿岸紅樹林資源豐富，紅樹林(mangrove)是熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落[4]。其生態系統是一個特殊復雜的生境，植物凋落物極其豐富，其中含有大量的纖維素、半纖維素等，紅樹林區絕大多數真菌都能產生降解纖維素和其他植物成分的酶[5]。目前，研究人員對陸地環境中的真菌研究較多[6-8]，而與紅樹林環境中真菌的分離鑒定、酶活及酶學性質分析等的相關研究相對較少。本研究從深圳福田紅樹林土壤環境中篩選高產纖維素酶、木聚糖酶的真菌菌株，并對其進行分子鑒定及酶學性質的研究。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采自于深圳福田紅樹林表層0～15 cm的土壤，選擇10個采集點，每點采集樣品約10 g。

1.2 培養基

1）馬丁氏瓊脂培養基[9]：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO41 g，MgSO4·H2O 0.5 g，瓊脂20 g，海水750 mL，加去離子水至1 L，121℃滅菌30 min，溫度降到50℃左右，加入青霉素、鏈霉素（其終濃度均為50μg/mL）。

2）液體種子培養基：mandels營養鹽濃縮液100mL/L，mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH 4.5）50 mL/L，吐溫801.5 mL/L。

3）纖維素酶產酶培養基：微晶纖維素粉30 g/L，mandels營養鹽濃縮液200 mL/L，mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L，葡萄糖3 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH 4.5）50 mL/L，吐溫801.5 mL/L。

4）木聚糖酶產酶培養基：玉米芯粉30 g/L，mandels營養鹽濃縮液200 mL/L，mandels微量元素濃縮液1.0 mL/L,葡萄糖3 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫801.5 mL/L。

1.3 方法

1.3.1 紅樹林土壤真菌的分離與篩選

將采集的樣品分別用無菌水適當稀釋，涂布于馬丁氏瓊脂培養基平板，37℃培養2d，挑取單菌落在馬丁氏瓊脂培養基平板上劃線純化分離3次，得到純種的真菌。

將純化菌株（無菌水洗孢子3mL）接種于含有30mL液體種子培養基的三角搖瓶中，于28℃，250 r/min條件下振蕩培養2d后，再取3 mL的液體種子接種于含有30 mL產酶培養基的三角搖瓶中于28℃，250 r/min條件下振蕩培養4 d后分別檢測其木聚糖酶及纖維素酶酶活。

1.3.2 木聚糖酶酶活測定

首先在試管中加入0.9 mL 0.5%的木聚糖溶液（由0.05 mol/L pH4.8的醋酸緩沖液配制）和0.1 mL適當稀釋的酶液，50℃恒溫水浴20 min后加入2 mL 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑終止反應，煮沸5 min，冷卻后測定其540 nm下的吸光值，以木糖作標準。酶活定義：1 mL酶液在50℃和pH 4.8條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmol木糖的量為1個酶活力單位，以IU表示。

1.3.3 纖維素酶活測定

在試管中加入0.9 mL 1%的微晶纖維素溶液（由0.05 mol/L pH4.8的檸檬酸緩沖液配制）和0.1 mL適當稀釋的酶液，50℃恒溫水浴20 min后加入2 mL DNS試劑終止反應，煮沸5 min，冷卻后測定其540 nm下的吸光值，以葡萄糖作標準。酶活定義：1 mL酶液在50℃和pH4.8條件下，每分鐘水解纖維素生成1 μmol葡萄糖的量為1個酶活力單位，以IU表示。

1.3.4 最適pH和最適溫度的測定

最適pH測定：配制pH1～pH12的緩沖液，分別在pH1～pH12條件下按照1.3.2及1.3.3方法測定木聚糖酶和纖維素酶活性。

最適溫度測定：用pH 4.8緩沖液配制底物，分別在10℃～80℃條件下按照1.3.2及1.3.3方法測定木聚糖酶和纖維素酶活性。

1.3.5 菌株的鑒定

形態觀察方法參考乳酸石碳酸棉藍染色液染色法[10]。

分子鑒定：提取真菌的基因組DNA,采用真菌5.8S rDNA通用引物ITS1及ITS4[11]擴增菌株的5.8S rDNAITS（內部轉錄間隔區，internal transcriber spacer）序列，對PCR產物進行切膠回收、測序，將所得序列與GenBank數據庫中序列進行tblastx分析比對。

2 結果與分析

2.1 分離菌株概況

深圳福田紅樹林土壤樣品經分離純化，在含抗生素的馬丁氏瓊脂培養基上涂布、劃線、純化，共分離得到80株真菌。把這80株真菌分別接到液體種子培養基、產酶培養基上復篩，得到2株（菌株1和菌株2）同時具有較高木聚糖酶和纖維素酶活的真菌。經測定，菌株1的木聚糖酶和纖維素酶活分別為42.16 IU和3.05 IU，菌株2的木聚糖酶和纖維素酶活分別為39.01 IU和0.87 IU。

2.2 2株紅樹林土壤真菌的形態觀察

菌株1和菌株2在馬丁氏培養基上的菌落特征和分生孢子結構見圖1。

圖1a顯示，菌株1在馬丁氏培養基上28℃培養7 d，直徑約60 mm，中間有臍狀突起而其他部分平坦；質地絨狀；分生孢子大量產生；分生孢子面先是粉紅色，后來變成暗綠色，菌落反面為黃褐色。圖1b顯示，菌株2在馬丁氏培養基上28℃培養7 d，直徑約65 mm，平坦并具有輻射狀溝紋；質地絲絨狀，分生孢子大量產生，主要聚集在菌落的中部，為灰褐色，菌落反面呈淡黃色。

圖1 菌株的菌落特征及分生孢子結構Fig.1 Characteristics of colony and conidia structure of two strains

經乳酸石碳酸棉藍染色液染色后，在40 X光學顯微鏡下觀察結果如下：圖1c顯示，菌株1其分生孢子梗莖壁平；帚狀枝通常二輪生，偶有三輪生；梗基每輪2～4個，彼此較緊貼；分生孢子近似于橢圓形，分生孢子鏈近于圓柱狀。圖1d顯示，菌株2其分生孢子囊為球形；分生孢子梗老時黃色或黃褐色，壁平滑；頂囊球形；分生孢子近似于球形。

2.3 2株紅樹林土壤真菌的分子鑒定

利用真菌5.8S rDNA通用引物ITS1及ITS4，分別從菌株1和菌株2的基因組DNA中擴增出一條特異性片段，序列大約600 bp。菌株1、2的基因組DNA及5.8S ITS PRC產物電泳圖分別見圖2、圖3。

圖2 兩菌株的基因組DNAFig.2 Genome DNA of two strains

圖3 兩菌株的ITS序列Fig.3 ITS sequence of two strains

將擴增的ITS序列PCR產物進行切膠回收、測序，并把測序結果與GenBank數據庫中序列進行tblastx比對分析，菌株1的ITS序列與Penicillium oxalicum strain XWSFJJ3（FJ977097）的相似性達到99.5%，同時結合形態觀察，可確定菌株1為草酸青霉（Penicillium oxalicum）；菌株2的ITS序列與Aspergillus piperis strain CBS 112811（FJ629352）的相似性達到99.6%，結合形態觀察，可確定菌株2為曲霉屬的Aspergillus piperis。

2.4 酶促反應最適溫度的測定

在不同的溫度條件下測定菌株1和菌株2的木聚糖酶活見圖4。

圖4 木聚糖酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of xylanase

由圖4可知，2種真菌的木聚糖酶活的最適溫度均為50℃，酶活分別為42.16 IU和39.01 IU；并且在40℃～60℃范圍內都能保持67.1%以上的酶活，尤其菌株1在70℃下仍保持64.3%的酶活，說明該菌產生的木聚糖酶具有一定的耐熱性，有較好的應用潛能。

在不同的溫度條件下測定菌株1和菌株2的纖維素酶活見圖5。

圖5 纖維素酶的最適溫度Fig.5 Optimum temperature of cellulase

同圖5可以看出，菌株1的纖維素酶的最適溫度是60℃，酶活為3.18 IU；菌株2的纖維素酶活的最適溫度是70℃，酶活為1.22 IU，盡管菌株2的纖維素酶活較低，但其具有一定的耐熱性，而且在30℃～80℃范圍內酶活活性變化不明顯，說明溫度適用范圍較廣。

2.5 酶促反應最適pH的測定

在不同的pH條件下測定菌株1和菌株2的木聚糖酶酶活，見圖6。

圖6 木聚糖酶的最適pHFig.6 Optimum pH value of xylanase

由圖6可知，菌株1木聚糖酶的最適pH為5.0，但在pH 4和pH 6時仍分別保持85.6%和84.1%以上的酶活；菌株2木聚糖酶的最適pH為4.0，在pH 4～8范圍內酶活變化不明顯，說明該木聚糖酶的pH適用范圍較廣，有利于酶在工業中的應用。但當pH大于9時，兩菌的木聚糖酶活明顯下降，在pH 12時幾乎沒有酶活。不同pH條件下菌株1和菌株2的纖維素酶酶活見圖7。

圖7顯示菌株1和菌株2纖維素酶的最適pH均為3.0。菌株1和菌株2在pH 2～5范圍內纖維素酶酶活變化不明顯，說明兩菌株均產生酸性纖維素酶。

圖7 纖維素酶的最適pHFig.7 Optimum pH value of cellulase

3 結論與討論

南海紅樹林產纖維素酶或木聚糖酶的土壤微生物廈門大學和海南大學已有報道[12-13]，但對分離菌株的分子鑒定及最適溫度、pH等特性并未有詳細數據。我們應用分子生物學手段，對菌株進行了分子鑒定，并對相關酶學性質進行了研究。

rDNA上的5.8、18和28 S rDNA基因有極大的保守性，同時絕大多數的真核生物都有極為廣泛的序列多態性，即親緣關系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現出差異,顯示最近的進化特征，這就是ITS序列在微生物種類鑒定的理論基礎[14]。從深圳福田紅樹林土壤環境中篩選的產纖維素酶、木聚糖酶的真菌菌株，根據ITS序列特征，本研究鑒定的2個菌株，其ITS序列與數據庫中已知菌株的序列相似性均高于99.5%，結合形態觀察的結果，最終確定菌株1為草酸青霉（Penicillium oxalicum），菌株2為曲霉屬的Aspergillus piperis。

本實驗中菌株2纖維素酶的最適溫度是70℃，屬于嗜熱纖維素酶[15]，可應用于農業,使纖維素降解為糖,再由糖轉化為乙醇,產嗜熱纖維素酶的工程菌可在高溫條件下大量生產酒精，為能源建設開辟新途徑。本實驗分離的兩菌株纖維素酶最適pH均為3.0，說明均具有較強的耐酸性，酸性纖維素酶可廣泛應用于釀酒、釀醋、果汁等食品工業中[16]。

由于酸性木聚糖酶在pH 4.0以下時仍然保持較高酶活性，可廣泛應用于飼料加工、釀酒工業、果汁加工等領域[17]。本研究所篩選的Penicillium oxalicum和Aspergillus piperis均具有較高的木聚糖酶酶活。今后將進一步優化培養條件和培養基組分，提高酶活性?？寺∠嚓P的功能基因，深入研究其酶學性質，為開發新型纖維素酶和木聚糖酶制劑奠定基礎。

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