類黃酮化合物的微生物代謝工程研究進(jìn)展

左芳雷，馬會(huì)勤，丁寅寅，趙建云，陳尚武，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，教育部-北京市功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

類黃酮是一組廣泛存在于植物中的多酚類物質(zhì)，屬于次級(jí)代謝產(chǎn)物，是存在于植物的葉、花、果中的天然色素，因多呈黃色而被稱為類黃酮[1]。在植物中，類黃酮起到抑制酶活性，螯合金屬離子，抵御紫外線、自由基、病原微生物危害等作用[2-3]。類黃酮還具有許多重要的生物學(xué)功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)血脂、雌激素樣作用等（注：“雌激素樣作用”學(xué)術(shù)上就是這種說(shuō)法，英文為Estrogenic Effect）[4-5]。因此，類黃酮被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和保健品行業(yè)中。

然而，類黃酮在植物中的含量很低，其提取率不超過(guò)干重的1%，而且成本高，不易標(biāo)準(zhǔn)化[6-7]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，采用基因工程手段構(gòu)建工程菌，使利用微生物發(fā)酵代謝生產(chǎn)類黃酮成為可能，為尋找類黃酮新來(lái)源開(kāi)拓了新的方法和思路，具有重要研究和生產(chǎn)價(jià)值。

1 類黃酮的結(jié)構(gòu)和功能

類黃酮泛指由2個(gè)苯環(huán)(A與B環(huán))通過(guò)中央三碳鏈相互結(jié)合的一系列C6-C3-C6化合物[1]，主要是指以2-苯基色原酮為母核的化合物。

天然的生物類黃酮多是其基本結(jié)構(gòu)的衍生物，而且多以糖苷形式存在，因此植物界中存在各種各樣的類黃酮物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的已達(dá)6000余種[8]。黃酮類化合物根據(jù)其中央三碳鏈的氧化程度、B-環(huán)聯(lián)接位置（2－或3－位）以及三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)狀等特點(diǎn)，可分為8類[9]：黃酮（flavones）、黃酮醇（flavonols）、黃烷酮（flavanones）、異黃酮（isoflavones）、黃烷醇（flavanols）、黃烷酮醇（flavanonols）、查耳酮（chalcone）及花青素（anthocyanidins）。常見(jiàn)食品中黃酮類化合物種類與結(jié)構(gòu)特點(diǎn)見(jiàn)表1[10]。

類黃酮具有突出的清除自由基、螯合金屬離子和抗氧化能力，這是由其特殊結(jié)構(gòu)決定的。一般認(rèn)為,生物類黃酮分子的α、β不飽和吡喃酮是其具有各種生物活性的關(guān)鍵[11-12]。7-OH糖苷化和2、3位雙鍵氫化均易引起類黃酮生物活性的降低，而A、B、C三環(huán)上的各種取代基則決定了其特定的生理功能。有效酚羥基理論[13]認(rèn)為，B環(huán)上的3’和4’鄰二羥基對(duì)清除自由基和機(jī)體組織中的脂質(zhì)過(guò)氧化物起決定作用，而在抑制油脂自動(dòng)氧化中，3-OH、5-OH、4-羰基和2、3 位的雙鍵則起主導(dǎo)作用。因此，清除超氧陰離子自由基的能力：蘆丁>槲皮素>桑色素>橙皮苷，而抑制油脂氧化的能力：槲皮素>桑色素>蘆丁≈橙皮苷。在離體條件下,類黃酮通過(guò)清除超氧陰離子和羥自由基抑制起始階段的脂類過(guò)氧化作用。類黃酮通過(guò)提供給過(guò)氧化基團(tuán)氫原子產(chǎn)生類黃酮自由基終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。類黃酮自由基反過(guò)來(lái)又和自由基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)終止傳遞鏈。除了具有抗過(guò)氧化的性質(zhì),類黃酮上相鄰的羥基或酮基能夠螯合金屬離子,而金屬離子往往是氧化反應(yīng)的催化劑和引發(fā)劑[14]。

表1 食品中常見(jiàn)黃酮類化合物和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[10]Table 1 Common flavonoids and their structural features in food

2 植物中的類黃酮合成途徑

植物的代謝分為初級(jí)代謝和次級(jí)代謝。植物的次級(jí)代謝有多條途徑，苯丙烷代謝途徑從碳流的角度來(lái)看，是植物最重要的次生代謝途徑之一，也是目前研究的較為透徹的次生代謝途徑之一。在一個(gè)細(xì)胞中，有20%以上的代謝會(huì)通過(guò)這條途徑，一切含苯丙烷骨架的物質(zhì)都是由這一途徑直接或間接生成的[15]。苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生木質(zhì)素、芪類、黃酮和花青素類化合物等次生代謝物的共同代謝物中間體，這些中間體參與后續(xù)代謝途徑就可以生成各種具有重要生物活性的植物次生代謝物。

類黃酮化合物是苯丙烷代謝途徑產(chǎn)物經(jīng)由類黃酮合成途徑得到的一系列植物次生代謝物，類黃酮合成途徑是苯丙氨酸代謝途徑的重要分支。主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸羥化酶（C4H）；4-香豆酸-輔酶A 連接酶(4CL)、查耳酮合成酶（CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（CHI）等幾個(gè)關(guān)鍵酶[16]。在這些次生代謝酶類中，PAL是研究的較為詳盡的酶，它使植物的次生代謝和初級(jí)代謝聯(lián)系起來(lái)。莽草酸途徑產(chǎn)生的苯丙氨酸經(jīng)PAL解氨作用生成反式肉桂酸，從而進(jìn)入苯丙烷代謝途徑生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物，PAL同時(shí)具有酪氨酸解氨酶（TAL）活性，可以利用酪氨酸代謝得到相同的產(chǎn)物。這些酸經(jīng)C4H和4CL作用可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的輔酶A酯。C4H是第一個(gè)被鑒定的植物細(xì)胞色素P450酶[17]，也是第一個(gè)既被克隆、又確定了功能的植物細(xì)胞色素P450酶，該酶行使功能需氧且依賴NADPH，它催化苯丙烷代謝途徑的第一個(gè)氧化反應(yīng)，在肉桂酸苯環(huán)結(jié)構(gòu)的對(duì)位上催化位置特異性的羥化反應(yīng)，將反式肉桂酸催化生成對(duì)-香豆酸；4CL催化各種羥基肉桂酸（香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等）生成相應(yīng)的輔酶A酯類。這幾步反應(yīng)的產(chǎn)物及由這些產(chǎn)物經(jīng)過(guò)其它代謝分支所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物統(tǒng)稱為苯丙烷類物質(zhì)。輔酶A酯類與3分子的乙酰輔酶A在CHS作用下生成查爾酮，由此進(jìn)入類黃酮物質(zhì)代謝途徑。查爾酮是植物花青素類色素和植物類黃酮物質(zhì)合成的前體[18]，在CHI催化下，或者在堿性條件下自發(fā)地生成相應(yīng)的黃烷酮。黃烷酮再經(jīng)過(guò)羥基化、烷化、氧化及糖苷化等反應(yīng)就能得到許多具有重要生理功能的類黃酮物質(zhì)。如由異黃酮合成酶（IFS）催化到得異黃酮；由花青素合成酶（ANS）催化得到花青素；由黃酮醇合成酶（FLS）催化得到黃酮醇等。

3 利用微生物合成類黃酮

類黃酮物質(zhì)由于其重要的生理功能，尤其是清除自由基及抗癌防癌等作用，而在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，類黃酮在植物中的含量很低，其提取成本高，得率低，品質(zhì)差，環(huán)境影響大；利用化學(xué)方法人工合成類黃酮也有很多局限，如安全性低，并且合成的類黃酮是兩種異構(gòu)體的混合物，然而只有（2S）-類黃酮才具有生物活性[19]；通過(guò)植物細(xì)胞培養(yǎng)合成類黃酮也受到細(xì)胞存活期短、成本高、不易大規(guī)模培養(yǎng)等限制[20-21]；利用植物基因工程可以合成包括異黃酮在內(nèi)的類黃酮物質(zhì)，但是產(chǎn)量很低，主要是由于植物體中有眾多的代謝支流，導(dǎo)致物質(zhì)和能量向類黃酮合成方向的流動(dòng)減弱[22]。

近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵的方法合成類黃酮化合物迅速興起。微生物生長(zhǎng)快、易培養(yǎng)，基因工程技術(shù)的便捷有效等等都是無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。在微生物中構(gòu)建類黃酮生物合成途徑并進(jìn)行發(fā)酵，有望實(shí)現(xiàn)類黃酮的大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)。現(xiàn)在構(gòu)建類黃酮生物合成途徑的主要宿主是大腸桿菌和釀酒酵母，而類黃酮合成相關(guān)基因的來(lái)源卻各有不同。

3.1 大腸桿菌

Hwang等[23-24]于2003年在大腸桿菌（E.coli）中構(gòu)建來(lái)自紅酵母（Rhodotorula rubra）的PAL,來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌A3（2）（Streptomyces coelicolor A3（2）的4CL 和來(lái)自甘草（Glycyrrhiza echinata）的CHS多酶基因體系，分別以3套質(zhì)粒系統(tǒng)來(lái)表達(dá)代謝產(chǎn)生黃烷酮類物質(zhì)：PAL-4CL-CHS連接一個(gè)T7啟動(dòng)子和一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)后與pET質(zhì)粒相連；3個(gè)基因分別攜帶各自的RBS，共同使用一個(gè)T7啟動(dòng)子與pET質(zhì)粒相連；3個(gè)基因攜帶各自的T7啟動(dòng)子和RBS與pET質(zhì)粒相連。攜帶第1套質(zhì)粒系統(tǒng)的工程菌株，可以以360 mg/L的酪氨酸和330 mg/L的苯丙氨酸為底物分別發(fā)酵得到0.570μg/L的柚皮素（Naringenin）和0.200μg/L的松屬素(pinocembrin)，攜帶第2套質(zhì)粒系統(tǒng)的工程菌株其產(chǎn)物的得率相比之下分別提高了85倍和43倍，而攜帶第3套質(zhì)粒系統(tǒng)的工程菌株其產(chǎn)物的得率卻得到了大幅度的提高，分別為794倍和3759倍，表明第3套系統(tǒng)代謝效率最高。這說(shuō)明重組基因表達(dá)盒的組合方式對(duì)類黃酮物質(zhì)的代謝生成有很大影響。另外，其構(gòu)建的途徑跳過(guò)了C4H基因，因?yàn)槭褂玫?CL基因來(lái)自于天藍(lán)色鏈霉菌A3（2），該酶既可以使用對(duì)-香豆酸（p-coumaric acid）為底物，也可以直接作用肉桂酸（Cinnamate）參與后續(xù)反應(yīng)[25]。代謝生成的松屬素和柚皮素為后續(xù)植物類黃酮物質(zhì)合成的重要前體。

不久，Watts等[26]在E.coli中導(dǎo)入了從模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆的PAL、C4H、4CL 和CHS基因，但因?yàn)殡y以表達(dá)得到有活性的C4H，所以反應(yīng)在第1步過(guò)后就中止了。于是，他們加入外源的對(duì)-香豆酸，代謝得到柚皮素，加入外源3-（4-羥苯基）丙酸（3－（4－h(huán)ydroxyphenyl）propionic acid），代謝得到根皮素（phloretin），加入外源阿魏酸（ferulic acid）和咖啡酸（caffeic acid）卻沒(méi)有代謝得到相應(yīng)的黃烷酮。該小組又用從紅假單胞菌（Rhodobacter sphaeroides）中克隆得到的酪氨酸解氨酶基因（TAL），替代了擬南芥PAL，并跳過(guò)了C4H，經(jīng)過(guò)48 h的發(fā)酵，可以代謝產(chǎn)生20.8 mg/L的柚皮素。

然而，以上研究所得到的類黃酮產(chǎn)量很低，不能進(jìn)行大規(guī)模的合成。有研究者通過(guò)增加宿主體內(nèi)丙二酰輔酶A（Malonyl coenzyme A）的含量來(lái)提高類黃酮的合成。丙二酰輔酶A是大腸桿菌的限制性代謝物，也是合成黃酮類化合物的基礎(chǔ)材料，由乙酰輔酶A羧化酶（ACC）催化乙酰輔酶A（Acetyl coenzyme A）生成。但是，超表達(dá)內(nèi)源ACC卻對(duì)大腸桿菌有害[27]。Miyahisa等[28]將來(lái)自酵母的PAL，來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌A3（2）的ScCCL以及來(lái)自甘草的CHS，來(lái)自葛根（Pueraria）的CHI共同構(gòu)建到pET載體上，另外，將來(lái)自谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）的乙酰輔酶A羧化酶基因（ACC）的兩個(gè)亞基（accBG和dtsR1）連接在pRSFDuet-1質(zhì)粒上，和上述pET表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可以大大提高柚皮素的產(chǎn)量，達(dá)到60 mg/L。

Leonard等[29]通過(guò)4個(gè)非同源質(zhì)粒將黃烷酮代謝途徑的幾個(gè)關(guān)鍵酶基因，即來(lái)自歐芹（Petroselinum crispum）的4CL，來(lái)自矮牽牛（Petunia x hybrida）的CHS和CHI，來(lái)自蘋果屬（Malus domestica）的黃烷酮3β-羥化酶基因（FHT），以及來(lái)自長(zhǎng)春花（Catharanthus Roseus）的類黃酮3’,5’-羥化酶基因（F3’5’H）和P450還原酶基因（CPR），導(dǎo)入到大腸桿菌中，加入各種前體物質(zhì)，幾乎可以發(fā)酵產(chǎn)生除楊梅酮（myricetin）之外的所有黃酮類物質(zhì)。研究者又將來(lái)自發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens）的ACC的4個(gè)亞基構(gòu)建到載體上，和以上4CL-CHS-CHI多基因體系在大腸桿菌中共表達(dá)，可以代謝合成196 mg/L的松屬素和67 mg/L的柚皮素。由于ACC的羧化酶功能依賴于生物素連接酶（BPL，由birA基因編碼）的作用，所以研究者又將birA與以上表達(dá)載體共表達(dá)，結(jié)果松屬素產(chǎn)量增加到367 mg/L。然而，生物素昂貴，限制了類黃酮物質(zhì)的大規(guī)模發(fā)酵。研究者又將乙酰輔酶A合成酶基因（ACS）導(dǎo)入大腸桿菌，與4CL-CHS-CHI和ACC共表達(dá)，代謝得到383 mg/L的松屬素，外源添加少量的醋酸鹽可以使松屬素產(chǎn)量增加到429 mg/L[16]。

通過(guò)以上研究可見(jiàn)，設(shè)法提高宿主胞內(nèi)丙二酰輔酶A的含量對(duì)類黃酮物質(zhì)的大量合成有著重要意義。Leonard等繼續(xù)對(duì)此進(jìn)行研究，通過(guò)增加宿主碳代謝途徑支路以及抑制非類黃酮合成途徑來(lái)增加類黃酮物質(zhì)合成的前體或輔因子，從而提高類黃酮的合成量。例如：將來(lái)自三葉草根瘤菌（Rhizobium trifolii）的基因matB和matC導(dǎo)入含有4CL-CHS-CHI重組基因的大腸桿菌宿主，可以將丙二酸鹽轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，添加外源丙二酸鹽的工程菌可以代謝合成480 mg/L的松屬素和155 mg/L柚皮素；為減少宿主本身丙二酰輔酶A的旁路流失，利用脂肪酸抑制劑淺藍(lán)菌素（cerulenin）抑制脂肪酸合成酶FabB/F，代謝得到的松屬素，柚皮素和圣草酚（eriodictyol）分別為710 mg/L，186 mg/L，和54 mg/L[30]。通過(guò)代謝工程手段調(diào)節(jié)大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)，使碳代謝流向丙二酰輔酶A合成的方向，為類黃酮合成所用，可以極大地提高類黃酮的得率[31]。

其它類黃酮化合物也通過(guò)相同手段在大腸桿菌中合成。Yan等[32]將來(lái)自蘋果屬的FHT和花青素合成酶基因（ANS），來(lái)自紅掌（Anthurium andraeanum）的二氫黃酮醇4-還原酶基因（DFR）和矮牽牛（Petunia hybrida）的UDP-葡萄糖：類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UFGT）構(gòu)建到大腸桿菌中，向培養(yǎng)基中添加68 mg/L的柚皮素或 28.8 mg/L的圣草酚，可以得到0.440 mg/L的山奈酚（Kaempferol）和 0.444 mg/L 的槲皮素（quercetin），但是花青素（Anthocyanin）的合成量卻很低。Miyahisa等[33]將來(lái)自歐芹的黃酮合成酶I基因（FNSI）導(dǎo)入含PAL-ScCCL-CHS-CHI重組基因的大腸桿菌中[28]，可由酪氨酸代謝生成13 mg/L的芹菜苷元（apigenin），由苯丙氨酸代謝生成9.4 mg/L的白楊素（chrysin）；將來(lái)自柑橘屬（Citrus）的FHT和黃酮醇合成酶基因（FLS）導(dǎo)入相同的工程菌中時(shí)，可由酪氨酸代謝生成15.1 mg/L的山奈酚，由苯丙氨酸生成1.1 mg/L的高良姜素（galangin）。另外還有一些黃酮類化合物也能在大腸桿菌中合成，但是合成量很低[34]。

郝佳等[35]利用單質(zhì)粒攜帶多個(gè)基因和多質(zhì)粒共同導(dǎo)入的方法，構(gòu)建了2套具有不同抗性的同源性pET質(zhì)粒，將完全來(lái)自大豆（Glycine max）的PAL、4CL、CHS、CHI、IFS等基因重組到大腸桿菌中進(jìn)行大豆異黃酮類物質(zhì)的代謝工程研究，但未見(jiàn)進(jìn)一步報(bào)道。

總的來(lái)看，通過(guò)基因工程和代謝工程手段，各類類黃酮化合物幾乎都可以在大腸桿菌中合成，但是目的基因來(lái)源不同，其產(chǎn)物得率差異很大，其生物代謝產(chǎn)量目前尚不足以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。另外，原核生物密碼子使用偏好性與植物差異較大，也是影響基因表達(dá)效率和產(chǎn)率的重要限制因素。

3.2 釀酒酵母

酵母菌是真核微生物，作為宿主系統(tǒng)比大腸桿菌有更多的優(yōu)勢(shì)。首先，酵母菌是公認(rèn)安全的微生物，可用于食品行業(yè)；更重要的是，它能夠表達(dá)有生物活性的細(xì)胞色素P450酶。細(xì)胞色素P450酶是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上混合功能氧化酶系統(tǒng)的末端氧化酶，類黃酮化合物合成的相關(guān)基因，包括C4H、IFS等，都屬于P450酶。以酵母菌為宿主，可以使得植物源基因的翻譯后修飾及酶學(xué)調(diào)控都和植物類似。因此，酵母菌是理想的合成類黃酮化合物的宿主菌。

Ro和Douglas[36]首次在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中構(gòu)建苯丙烷類代謝途徑起始多酶系基因PAL,C4H和CPR。分別由從白楊（Populus trichocarpa X Populus deltoides）來(lái)的兩種苯丙氨酸解氨酶基因PAL2和PAL4構(gòu)建了兩個(gè)系統(tǒng)，PAL2-C4H-CPR和PAL4-C4H-CPR，研究了從苯丙氨酸到對(duì)-香豆酸過(guò)程中碳的代謝機(jī)制。另外，放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在酵母菌中C4H可以利用宿主內(nèi)生的肉桂酸，而無(wú)需導(dǎo)入外源的PAL。

Jiang等[37]在釀酒酵母中構(gòu)建來(lái)自紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）的PAL，來(lái)自擬南芥的4CL和來(lái)自金絲桃（Hypericum androsaemum）的CHS多酶基因體系，由于該系統(tǒng)利用了來(lái)自真菌的PAL，它同時(shí)具有酪氨酸解氨酶（TAL）活性，從而跳過(guò)了C4H。每個(gè)基因在各自的GAL10啟動(dòng)子的控制下可以高效表達(dá)，由內(nèi)源苯丙氨酸和酪氨酸可代謝產(chǎn)生7 mg/L的柚皮素，0.8 mg/L松屬素，9 mg/L的根皮素，同時(shí)也檢測(cè)到了很多其它中間代謝物的產(chǎn)生。

Yan等[38]在釀酒酵母中導(dǎo)入來(lái)自擬南芥的C4H，來(lái)自歐芹的4CL，來(lái)自矮牽牛的CHS和CHI多基因體系，代謝生成類黃酮物質(zhì)并產(chǎn)生一系列中間代謝產(chǎn)物。此工程菌能以148.16 mg/L肉桂酸合成16.3 mg/L的松屬素，以164.16 mg/L對(duì)-香豆酸合成28.3 mg/L的柚皮素，以180.16 mg/L咖啡酸合成6.5 mg/L的圣草酚。Leonard等[39]再將來(lái)自歐芹的FNSI或來(lái)自金魚(yú)草（Antirrhinum majus）的FNSII，與來(lái)自酵母的CPR導(dǎo)入到含PALScCCL-CHS-CHI重組基因的酵母菌[29]。可以代謝合成芹菜苷元和木犀草素（luteolin），白楊素只有在fnsI表達(dá)時(shí)合成。

Katsuyama等[40]采取了酵母和大腸桿菌共同發(fā)酵的策略。大腸桿菌攜帶來(lái)自酵母的PAL，來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌的ScCCL，來(lái)自甘草的CHS，來(lái)自葛根的CHI和來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的ACC，酵母攜帶來(lái)自甘草的IFS，二者在添加了酪氨酸的培養(yǎng)基中共同發(fā)酵，可以由543 mg/L酪氨酸代謝產(chǎn)生6 mg/L的染料木素（genistein）。這說(shuō)明，利用酵母和大腸桿菌雙宿主系統(tǒng)發(fā)酵合成類黃酮物質(zhì)是可行的，能夠避免細(xì)胞色素P450酶難以在原核生物中有效表達(dá)這一障礙。

然而，即便是酵母染色體本身攜帶CPR基因，但是當(dāng)外源P450酶超表達(dá)時(shí)，酵母內(nèi)源CPR活性卻是限制性因素[41]。共表達(dá)植物源的CPR基因相比卻能提高產(chǎn)物的得率，說(shuō)明酵母內(nèi)源CPR基因不足以支持P450酶的高效表達(dá)[41-42]。Trantas等[42]將來(lái)自白楊的PAL、CPR 基因，來(lái)自大豆的C4H、4CL、CHS、CHI、IFS、F3H（黃烷酮3-羥化酶基因）、F3’H（類黃酮3’-羥化酶基因）以及來(lái)自馬鈴薯（Solanum tuberosum）的FLS構(gòu)建到釀酒酵母中，重組菌可以代謝得到8.9 mg/L～15.6 mg/L的柚皮素，0.1 mg/L～7.7 mg/L的染料木素，0.9 mg/L～4.6 mg/L的山奈酚以及0.26 mg/L～0.38 mg/L的槲皮素。

Naesby等[43]將類黃酮合成的相關(guān)基因構(gòu)建到酵母人工染色體（YAC）上，使得重組基因可以在宿主中穩(wěn)定遺傳，可以代謝得到柚皮素0.858 mg/L，山奈酚0.235 mg/L，同時(shí)也得到了其它類黃酮物質(zhì)及中間產(chǎn)物。這是一個(gè)不同以往的在酵母菌中構(gòu)建類黃酮代謝途徑的方法，允許合成多種結(jié)構(gòu)不同的類黃酮化合物，而且遺傳穩(wěn)定性好。

3.3 其它微生物

Parka等[44]將來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌的ScCCL和來(lái)自擬南芥的CHS構(gòu)建到表達(dá)載體pSE34（包含強(qiáng)啟動(dòng)子PermE）上，導(dǎo)入到委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces Venezuela）中。采取與H wang等[23]同樣的方法，構(gòu)建兩類質(zhì)粒系統(tǒng)。當(dāng)ScCCL和CHS分別攜帶各自的RBS，共用一個(gè)PermE啟動(dòng)子時(shí)，可以代謝合成0.2 mg/L的柚皮素和0.4 mg/L的松屬素；當(dāng)ScCCL和CHS分別攜帶各自的RBS和啟動(dòng)子時(shí)，柚皮素和松屬素的合成量分別提高6倍（1.2 mg/L）和5倍(2.0 mg/L)。這再次說(shuō)明重組基因表達(dá)盒的組合方式對(duì)產(chǎn)物的合成有很大影響。又將來(lái)自擬南芥的CHS進(jìn)行了密碼子偏好性改造，結(jié)果柚皮素和松屬素的合成量顯著增加，達(dá)到4.0 mg/L和6.0 mg/L。這表明對(duì)外源基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化是提高產(chǎn)物合成量的有效途徑。

4 總結(jié)與展望

以上研究證明，利用大腸桿菌和釀酒酵母為宿主，構(gòu)建類黃酮合成途徑，發(fā)酵生產(chǎn)類黃酮化合物是有效的，這表明利用基因工程以及代謝工程手段同樣可以發(fā)酵生產(chǎn)其它種類的天然化合物。另外，也可以考慮利用其它微生物為宿主，如絲狀真菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。

在微生物中構(gòu)建類黃酮合成途徑，最重要的一個(gè)障礙仍然是C4H、IFS等細(xì)胞色素P450酶的有效表達(dá)問(wèn)題。C4H、IFS酶行使功能要依附于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，需氧且依賴NADPH，而大腸桿菌缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。一般的解決辦法是利用來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌的ScCCL替代植物4CL，同時(shí)跳過(guò)C4H。也有人利用TAL替代PAL，或者直接利用PAL的TAL活性發(fā)酵酪氨酸，也可以跳過(guò)C4H。另外，利用釀酒酵母和大腸桿菌共同發(fā)酵的方法，用酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和P450還原酶來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞色素P450酶的功能也是一個(gè)很好的選擇。還有研究者將P450酶與P450還原酶融合起來(lái)，形成嵌合體，也可以實(shí)現(xiàn)P450酶在大腸桿菌中的有效表達(dá)[16，45]，而在酵母菌中，不必將P450酶與P450還原酶融合，只要共表達(dá)二者就可以提高P450酶的活力[46]。

對(duì)于不同來(lái)源的類黃酮合成相關(guān)基因，在宿主菌中的表達(dá)效率各有不同。針對(duì)宿主菌的密碼子占用頻率，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化能夠提高基因在相應(yīng)宿主中的表達(dá)效率。另外，目標(biāo)基因的選擇及其表達(dá)元件的組合方式，合適的啟動(dòng)子和相匹配的宿主菌選擇對(duì)類黃酮合成效率的影響也很大。利用基因工程手段超表達(dá)所需要的基因，同時(shí)抑制代謝支路的基因可以使能量及物質(zhì)向合成類黃酮的方向流動(dòng)，從而提高類黃酮的合成產(chǎn)率。

在工程菌發(fā)酵過(guò)程中，利用發(fā)酵工程技術(shù)優(yōu)化培養(yǎng)條件，如工程菌培養(yǎng)密度以及不同的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)條件，可以使得工程菌最大限度地合成類黃酮。

總的來(lái)看，關(guān)于類黃酮化合物的微生物代謝工程的研究已經(jīng)有了很多基礎(chǔ)，可以實(shí)現(xiàn)工程菌發(fā)酵生產(chǎn)類黃酮。然而，利用微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)類黃酮的大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)還需要更進(jìn)一步的研究。

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