HPLC-ICP-MS聯用技術在有機砷形態分析中的應用

肖亞兵，閻華，陳其勇

（1.天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461；2.湖北省武漢市青山區環保局，湖北 武漢 430080）

砷是一種毒性很強的元素，砷的毒性主要取決于其化學形態，因此現在對砷的形態分析研究越來越多，其中有機砷的形態分析倍受重視。有機砷的形態包括很多種，見表1，有機砷的形態不同，其毒性差異也很大。一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）已被證明是潛在的致癌物質[1]，而砷甜菜堿（AsB）和砷膽堿（AsC）則被認為是無毒的[2]。近幾年來，有機砷制劑作為一種飼料添加劑廣泛應用于家禽養殖業[3]。有機砷類制劑具有刺激動物生長的作用，而且具有較廣的抗菌譜，可以改善禽肉的肉質。有機砷類制劑主要包括阿散酸（p-ASA）、洛克沙砷（3-ROX）、硝基苯砷酸（4-NPAA）和脲基苯砷酸（p-UPAA）。雖然有機砷的毒性很低，但大劑量作用時，也會導致中毒，如洛克沙砷可使動物中樞神經系統失調，使腦病和視神經萎縮的發病率提高。另外還能夠對環境造成很大的污染，畜禽日糧中如果大量使用有機砷制劑，其含砷的畜禽排泄物進入環境，使土壤、空氣、水遭受嚴重污染。因此在食品和環境樣品中進行有機砷的形態分析是有必要的。

表1 幾種常見的有機砷形態化合物Table 1 List of organicarsenic species compounds

有機砷的形態分析通常包括兩步：一是各種有機砷形態的分離，二是對各種有機砷形態的檢測。雖然有機砷的形態分析方法包括很多，如分光光度法[4-5]、電化學法[6]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[7-9]、液相色譜法[10]、液相色譜-質譜-質譜法（LC-MS-MS）[11-12]、原子吸收法（AAS）[13-14]、電感耦合等離子體-原子發射光譜法（ICPAES）[15]、原子熒光法（AFS）[16]，但高效液相色譜-電感耦合等離子體-質譜（HPLC-ICP-MS）聯用技術應用最為廣泛。HPLC是一種具有高效、高靈敏度的分離手段，尤其適用于熱穩定性差、分子量大、極性強的物質的分離，根據分離機制的不同，液相色譜有多種分離方式。ICP-MS分析技術具有極低的檢測限、寬的線性范圍、干擾少、分析精密度高、速度快和可同時測定多元素等優點，能在復雜基體中準確的分析痕量元素。特別是ICP-MS作為HPLC的檢測器，跟蹤被測元素在各形態中的信號變化，使得色譜圖變得簡單，消除了基體干擾，有助于元素形態確認和進行定量分析。因此HPLCICP-MS聯用技術已成為有機砷形態分析的強有力的手段。本文將就HPLC-ICP-MS聯用技術在有機砷形態分析中的應用作一綜述。

1 HPLC與ICP-MS聯用接口技術

ICP-MS在元素形態分析中的應用已有了大量的介紹[17]。在ICP-MS分析中，ICP的原子化和離子化結合了質譜（MS）的特異性和檢測的靈敏性。ICP具有高效及強大的電離源，等離子體能在5000K-10000 K的溫度和常壓下工作，當樣品霧化進入等離子源后，被分析物氣化、原子化和離子化幾乎同時進行，最后被測元素進入質譜來檢測。

HPLC與ICP-MS聯用的關鍵是接口技術，即樣品溶液經HPLC分離后在線的引入ICP的霧化系統。ICPMS是為液體樣品基質而設計的，HPLC柱與霧化器連接也沒什么問題，而且HPLC的柱后流出液的壓力與ICP樣品導入系統都是在常壓下進行的，因此將HPLC與ICP聯機就變得十分簡單。HPLC與ICP接口技術與檢測器的類型有很大關系，HPLC應用的主要原則之一就是流動相要與檢測系統相匹配。HPLC流動相的流速通常為0.1 mL/min～1 mL/min，這與ICP常用的氣動式霧化器：交叉流（cross flow）霧化器、Babington霧化器和同心（concentric）霧化器的樣品導入流速是相匹配的。而當使用UV檢測器時，通常在反相HPLC中用鈉或鉀的磷酸鹽緩沖溶液做流動相，因為磷酸鹽緩沖溶液在紫外區沒有吸收，但這種緩沖溶液做流動相卻不適合于質譜檢測器。非揮發性緩沖鹽溶液聚集在lenses和skimmer cones上，從而導致信號不穩定和“記憶”效應。因此對ICP-MS來說，要使用揮發性緩沖鹽溶液或是在ICP-MS系統中殘留低的溶劑[18]，有機酸的銨鹽和碳酸銨由于其低殘留就很適合于ICP-MS。也有將硝酸作為砷形態分析的流動相，但是在砷形態峰中有As5+的峰，所以具有氧化性的硝酸做流動相不適用于砷的形態分析。另外，HPLC的流動相中通常含有一定比例的有機溶劑，如甲醇和乙睛等，有機溶劑在ICP中所產生的碳可造成ICP-MS的進樣管和采樣錐、截取錐兩錐孔變得越來越小甚至堵塞，導致ICP-MS的信號不穩定，因此可在溶劑到達ICP前將樣品溶液霧化成氣溶膠，或降低噴射室溫度使溶劑濃縮都能起到去溶作用，從而保持ICP的穩定。超聲霧化是ICP的一種樣品導入方式，超聲霧化器是用超聲波的振動作用將樣品溶液霧化成氣溶膠，能以很高的效率獲得霧滴顆粒小、分布均勻的高質量的氣溶膠，大大提高了霧化效率而改善ICP-MS的檢測限。但超聲霧化器易受溶液性質（如黏性、顆粒等）的影響，具有一定的“記憶”效應。在HPLC柱后采取低流速或者使用小孔或微孔柱也可以減少有機溶劑進入檢測器的量，小孔和微孔柱是HPLC色譜柱技術的發展方向，它可以降低流動相的消耗量并且降低組分在色譜柱分散變寬，提高柱效。與傳統柱徑如4.6 mm相比，小柱徑的種類很多，如2.0 mm、1.0 mm的微柱及300 μm的毛細柱，相應的其流動相的流速在0.01mL/min～0.1mL/min之間。如Pergantis[19]等使用1mm的微柱,以流速0.04mL/min分離了洛克沙砷等有機砷飼料添加劑。

2 有機砷形態的HPLC分離

HPLC具有高度樣品預處理能力，不需復雜的萃取和衍生步驟，比較適合于非揮發性物質的分離，因此在有機砷的分離中普遍采用HPLC法，有機砷化合物的物理、化學性質（如pKa值、極性、可溶性等）影響著HPLC系統的選擇。如一甲砷酸（MMA）的pKa值有兩個：2.6，8.2；二甲砷酸（DMA）的pKa值是6.2；砷甜菜堿的pKa值是2.2；而其它有As=O鍵的有機砷在低pH條件下易質子化而顯陽離子。對有機砷制劑（如阿散酸、洛克沙砷）來說，由于其弱酸性，因而降低流動相的pH（如添加少量三氟乙酸或甲酸）可以改善其峰形。如肖亞兵[20]等以甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液（1∶9）為流動相，HPLC-ICP-MS法同時測定了動物源性食品中阿散酸、洛克沙砷和硝苯砷酸的殘留量。Thompson[21]是最先提出HPLC和ICP-MS聯用的，在他們的研究中，HPLCICP-MS檢測砷的絕對檢測限為0.1 ng～0.2 ng。在有機砷形態分析中，使用比較廣泛的是離子交換色譜（ionexchange chromatography）和離子對色譜（ion-pair chromatography）。如前所述，ICP-MS對砷的低檢測限以及與HPLC聯結的容易性使得ICP-MS成為有機砷形態分析最佳的方法。另外膠束色譜也應用于一些有機砷的形態分離。本文主要從離子交換色譜和離子對色譜兩個部分來描述不同的色譜分離模式。

2.1 離子交換HPLC

離子交換色譜主要是用于離子和易離子化的物質的分離，其機理是利用固定相中的表面活性離子與流動相中相反電荷離子的交換平衡。包含兩種類型：表面活性離子帶負電荷的稱為陽離子交換色譜，帶正電荷的稱為陰離子交換色譜。溶質的離子強度、緩沖溶液的濃度和離子強度、溫度以及流動相的pH、流速和流動相中的有機溶劑都影響著被分析物的分離和保留時間。離子交換色譜在有機砷形態分析中應用十分廣泛，陰離子交換常用于MMA和DMA的分離，而陽離子交換常用于分離AsB、AsC、TMAO和Me4As+。劉桂華[22]等采用陰離子交換柱來分離紫菜萃取物中的MMA、DMA。Suzuki[23-24]等用36 mmol/L甲酸和2 mmol/L甲酸銨（pH2.8）水溶液為流動相，以流速為0.8 mL/min在Shodex Rspak NN-614（150 mm×6.0 mm）陽離子交換柱上分離MMA、DMA和AsB。通常用于離子交換色譜分離極性砷化合物的緩沖系統包括：磷酸鹽、碳酸鹽、苯二甲酸、氫氧化四甲銨和甲酸鹽緩沖液。如前所述，鈉或鉀的磷酸鹽緩沖液由于在ICP-MS的進樣器和skimmer cones上有殘留而不被采用，而碳酸銨由于殘留少，長時間使用后也無信號漂移常用于陰離子交換系統中。在B‘Hymer和Caruso[18]的報道中，即使色譜運轉15 h以后，進樣器和skimmer cones上也沒有過多的殘留，這是因為在5000 K～10000 K的等離子體中，除了氨、CO2和水外沒有別的殘留。所以碳酸銨是用于ICP-MS的最好緩沖液。苯二甲酸、甲酸及氫氧化四甲銨緩沖液用在ICPMS上也有同樣的優點。

在傳統的離子交換系統中，等度洗脫是比較常用的。這種洗脫方式可用于一些中性的砷形態化合物。不論是等度洗脫還是梯度淋洗的離子交換系統都能適合于有機砷的形態分離，在已報道的文獻中，等度洗脫占主要地位，B.P.Jackson等[25]使用了3種離子色譜柱來分離ROX、p-ASA、DMA、和MMA：在As14柱中使用磷酸根洗脫劑，在As16柱中使用羥基洗脫劑，在As7柱中使用HNO3作洗脫劑都使這些化合物得到了很好的分離。3種方法對所有種類的有機砷化合物的檢測限都低于0.5μg/L，而As16和As7柱中檢測限都低于0.05μg/L。梯度淋洗與等度洗脫相比有較高的塔板數、較好的形態分離效果以及較少的保留時間。B‘Hymer和Caruso[18]使用陰離子交換柱Hamilton PRP-X100（150 mm×4.1 mm i.d.），流動相A（12.5 mmol/L碳酸銨）和流動相B（50 mmol/L碳酸銨），以流速0.8 mL/min，梯度洗脫程序：0 min～8 min，100%A；8 min～20 min，100%A-100%B；20 min～30 min，100%B分離了AsC、AsB、MMA和DMA。Sloth[26]等還利用梯度陽離子交換系統來分析海產品中的有機砷形態。

另外，在等度多模式離子交換系統中，硝酸銨和硝酸緩沖液被用來分離標準水溶液中的MMA、DMA和AsB，此方法[27]也用于土壤水的測定。

2.2 離子對HPLC

用于有機砷形態分離的離子對色譜類型為反相離子對色譜。簡單的反相HPLC使用的流動相是含有有機溶劑的水溶液，固定相的極性小于流動相。在反相離子對色譜中，將反離子水溶性緩沖溶液加入到流動相中，利用離子對生成的化學平衡來調節各形態的選擇和保留，離子對HPLC最大的優點是能分離離子形態以及不帶電的分子形態。常用的離子對試劑是長鏈的烷基離子，如烷基磺酸鹽（通常含有5個以上的碳鏈）和四烷基銨鹽。流動相中離子對試劑的濃度較低（約0.02 M或更低），洗脫及分離時采用含有機試劑的水溶液，當用ICP-MS檢測有機砷形態時用甲醇溶液。在離子對色譜中，被分析物的分離受以下幾個因素的影響：反離子的疏水性、離子對試劑的濃度、緩沖液的濃度、流動相的pH和離子強度以及固定相的特性。由于反相離子對色譜操作簡便、柱效高，因此廣泛應用于有機砷形態的分離。Pergantis[19]等采用反相離子對微孔高效液相色譜-電感耦合等離子體-質譜法（RP-IP-HPLC-ICPMS）分別檢測了4種有機砷動物飼料添加劑，羥基苯砷酸和阿散酸的檢測限為0.10μg/L，洛克沙砷的檢測限為0.12μg/L，硝苯砷酸的檢測限為0.26μg/L，該法所需樣品體積少(＜1μL，流動相流速低（15μL/min～40μL/min），產生的廢棄物少，而且選擇性和靈敏度高。B‘Hymer[28]等實驗了不同的噴霧器，用pH2.4的含有25 mmol/L檸檬酸和10 mmol/L五烷基磺酸鈉的水溶液為流動相，小孔C18柱等度離子對HPLC分離了MMA、DMA、AsB和AsC，該法對各有機砷化合物的檢測限都在1μg/L以下。在HPLC-ICP-MS檢測有機砷形態中，一般不采用梯度離子對HPLC，因為流動相中的有機成分改變會造成信號漂移。B‘Hymer和Caruso[18]用含有40 mmol/L檸檬酸和10 mmol/L六烷基磺酸鈉的水溶液為流動相來分離MMA、DMA、AsB和AsC的標準溶液，水相-有機相（甲醇）的比例在30 min內由流動相A（98∶2或96∶4）逐漸增加有機相（甲醇）到流動相B（88∶12或86∶14）。在此研究中，無法解決MMA的峰形，而且ICP-MS系統中基線出現了漂移。使用離子對HPLC快速洗脫有機砷形態化合物是一種新趨勢。Wrobel[29]等使用七烷基磺酸鈉和檸檬酸緩沖系統在4 min內將MMA、DMA和AsB粗略的洗脫出來。雖然這種色譜系統能夠縮短洗脫時間，但對As5+和MMA缺乏分離能力。因此快速色譜系統與傳統色譜系統相比較雖然縮短了被分析物的保留時間，但對被分析物的分離效果不好，特別是當樣品基質影響到色譜的分離時。

3 總結與展望

有機砷的形態分析在今后會越來越重要，HPLCICP-MS聯用技術是迄今為止有機砷形態分析最有效的途徑，它融合了HPLC穩定、高效分離的特點和ICPMS具有的靈敏度高、線性范圍寬及能跟蹤被測元素在各形態中的信號變化，使色譜圖變得簡單，有助于元素形態的確認等優點。雖然將HPLC與ICP-MS連接非常簡單，但其帶進ICP中的有機溶劑多，因而HPLC-ICPMS是該技術檢測有機砷形態的發展方向。另外相應的與ICP-MS的接口裝置也是該聯用技術發展的重點，氫化物發生（HG）-一種柱后衍生過程是ICP-MS檢測有機砷形態的較好接口裝置，具有高靈敏度、低檢測限及能更好的將被分析物傳送到ICP-MS等優點。Nakazato[30]等使用HG接口檢測了海水樣品中的MMA，Yehl[31]等也使用HG測定了土壤提取液中的有機砷形態。

另外，在有機砷形態分析中，樣品的前處理也是非常重要的。無論采取什么樣的提取方法都必須保證將樣品中的有機砷形態“原樣的”分離出來，因此發展應用各種有效的前處理技術也是有機砷形態分析的關鍵步驟。

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