鯰魚骨酶解物抑菌性能研究

任小青，馬儷珍，儲炬

（1.華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.天津農學院 食品科學系，天津 300384；3.天津市農產品加工科技創新與成果轉化基地，天津 300384）

鯰魚（Catfish）屬鯰形目，鯰科，是古老魚類之一，具有適應性強、繁殖率高等特點，是極為重要的經濟魚類[1]。近年來，國內以鯰魚為主的淡水漁業得到了飛速發展，由天津農學院和天津德仁水產養殖有限公司共同承擔的“革胡子鯰設施化高效養殖技術研究項目”，通過高密度、集約化養殖，使革胡子鯰單位年產量提高了近40倍[2]。隨著鯰魚產量的增加，鯰魚被加工成不同的產品，在加工過程中，大量的魚頭、魚骨、魚皮、內臟等廢棄物產生，這些下腳料若不加以有效利用，不僅造成極大的浪費，而且還會對環境造成污染[3]。本實驗室以鯰魚加工下腳料魚骨為原料，通過胃蛋白酶酶解得到了具有抑菌性能的酶解物[4]。在此基礎上，本文進一步研究該酶解物的抑菌能力，為實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

鯰魚：天津市德仁水產養殖中心。胃蛋白酶（pH 3.0，活力1.25萬U/g）：購自天津諾奧酶制劑公司。供試菌種大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和藤黃微球菌（M.luteus）為天津農學院食品科學系生物工程教研室保存。培養基為牛肉膏蛋白胨培養基。培養基配方：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，pH 7.2。

電子分析天平（FA1104A）、電子天平（JT3101N）：上海精密實驗設備有限公司；電熱恒溫水浴鍋（WHY-2）：天津市華北實驗儀器有限公司；離心機（TDL-5）：上海安亭科學儀器廠；冰箱（BCD-241WE/Y）：海爾科技有限公司；滅菌鍋（YX2808）：上海三申醫療器械有限公司；超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；恒溫培養箱：天津市天宇技術實業有限公司；722型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯰魚骨酶解物的制備[4]

將新鮮鯰魚的魚頭、魚骨清洗干凈，進行蒸煮、干燥和粉碎處理后以胃蛋白酶進行酶解。酶解的工藝條件為：底物濃度0.15 g/mL，加酶量1.97 g/100 g，酶解溫度40℃，酶解時間4.0 h，pH 3.5。酶解后85℃滅酶10 min，離心20 min（4000 r/min）得上清液，上清液冷凍干燥制得具有抑菌性能的酶解物，-20℃儲存備用。

1.2.2 菌種的活化培養

將-18℃甘油保藏菌種大腸桿菌（E.coli）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和藤黃微球菌（M.luteus）按1%接種量接種于液體牛肉膏蛋白胨培養基中或于固體牛肉膏蛋白胨培養基上劃線培養，反復三次進行活化。

1.2.3 瓊脂孔穴擴散法測定抑菌活性

在直徑為9 cm的平皿內傾倒15 mL牛肉膏蛋白胨固體培養基以及調整好濃度的處于對數生長期的各株細菌，使培養基內的細菌終濃度為106CFU/mL，待其凝固后用無菌打孔器打直徑為6 mm的孔，孔中加入35 μL骨酶解液，將平皿置于恒溫培養箱中37℃培養18 h，測量其抑菌圈直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度的測定（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）

采用瓊脂稀釋法，用融化并保溫在50℃的固體培養基將骨酶解物配成不同濃度，分別為10 mg/mL，8、6、4、2和0，倒平板，待其凝固，吸取0.1 mL培養到對數生長期濃度為106CFU/mL的菌液，用滅菌涂棒涂布均勻，置于37℃培養箱中培養24 h，觀察并記錄結果，以與培養基表面無菌落生長相對應的最小酶解物濃度為酶解物對各菌的最低抑菌濃度。以不加酶解物的各菌平板為對照。

1.2.5 最低殺菌濃度的測定（Minimal Bactericidal Concentration，MBC）

將1.2.4中大于及等于最低抑菌濃度的培養基表面用無菌水沖洗，將沖洗液接種到無酶解物的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，用滅菌涂棒涂布均勻，置于37℃培養箱中培養24 h，觀察并記錄實驗結果，以與培養基表面無菌落生長相對應的最小酶解物濃度，即為酶解物對各菌的最低殺菌濃度。

1.2.6 比濁法測定細菌生長抑制曲線

稱取一定量的骨酶解物，用牛肉膏蛋白胨培養基將其稀釋成為各菌MIC，各菌種接種量均為5%，以不加酶解物的培養基接種作為空白對照，置于37℃下恒溫振蕩培養，定時取樣測定其吸光度值，用吸光度值的變化反映濁度的變化，即細菌數量的變化。

1.2.7 加熱時間對鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響

以大腸桿菌為供試菌，將其對應的最低抑菌濃度的酶解物在沸水浴中加熱5、10、15、20、30、60 min，用1.2.3方法檢測其抑菌活性變化，同時以未煮沸的最低抑菌濃度的酶解物作對照。

1.2.8 不同pH對鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響

以大腸桿菌為供試菌，配制緩沖液調節最低抑菌濃度的酶解物的pH至5、6、7、8、9，用1.2.3的方法檢測其抑菌活性變化，同時以未調pH的最低抑菌濃度的酶解物作對照。

2 結果與分析

2.1 最低抑菌濃度MIC和最低殺菌濃度MBC的測定

將鯰魚骨酶解物采用瓊脂稀釋法配成10 mg/mL，8，6，4，2和0不同濃度分別測定其對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的MIC和MBC。測定結果見表1和表2。

表1 鯰魚骨酶解物對各菌最低抑菌濃度（MIC）的測定Table 1 Minimal inhibitory concentration（MIC）of enzymatic hydrolysis of catfish bone

表2 鯰魚骨酶解物對各菌最低殺菌濃度（MBC）的測定Table 2 Minimal bactericidal concentration（MBC）of enzymatic hydrolysis of catfish bone

從表1和表2可以看出，鯰魚骨酶解物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌均具有很好的抑制作用，其中對藤黃微球菌抑制作用最強，其MIC和MBC分別是6 mg/mL和8 mg/mL。

2.2 比濁法測定細菌生長抑制曲線

以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌為對象菌，研究鯰魚骨酶解物對其抑制效果，圖1～圖3分別為骨酶解物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的生長抑制曲線圖。

由圖1～圖3可以看出，分別以正常培養的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌為陰性對照，當加入鯰魚骨酶解物后，各菌的生長曲線均發生了明顯的變化。這說明鯰魚骨酶解物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌均有抑制作用而且抑制作用均發生在延遲期和對數生長前期。

圖1 鯰魚骨酶解物對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis of catfish bone on E.coli growth curve

圖3 鯰魚骨酶解物對藤黃微球菌生長曲線的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis of catfish bone on M.luteus growth curve

2.3 加熱時間對鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響

將8 mg/mL的鯰魚骨酶解物在沸水浴中加熱5、10、15、20、30、60 min，檢測其對大腸桿菌抑制活性變化，結果見圖4。

圖4 加熱時間對鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響Fig.4 Effect of heating time on the antibacterial activity of enzymatic hydrolysis of catfish bone

由圖4可以看出，最低抑菌濃度的酶解物在沸水浴中加熱不同時間后，隨處理溫度的升高，對大腸桿菌的抑菌活性略有下降，但是整個曲線的變化過程較為平緩，抑菌圈直徑與對照相差不大。這說明高溫長時間處理對鯰魚骨酶解物的抑菌活性影響較小，提取物具有較好的熱穩定性。

2.4 不同pH對鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響

配制緩沖液調節8 mg/mL的鯰魚骨酶解物pH至5、6、7、8、9，檢測其抑菌活性變化，結果見圖5。

圖5 pH對鯰魚骨酶解物抑菌性能的影響Fig.5 Effect of pH on the antibacterial activity of enzymatic hydrolysis of catfish bone

由圖5可以看出，8 mg/mL的鯰魚骨酶解物的抑菌性能受pH影響較大，隨著pH的增大，抑菌性能迅速降低，這可能是由于堿性環境破壞了鯰魚骨酶解物中抑菌活性物質的結構。

3 結論

本實驗結果表明，鯰魚骨酶解物均能很好的抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的生長，其中對藤黃微球菌抑制作用最強，其MIC和MBC分別是6 mg/mL和8 mg/mL。而且鯰魚骨酶解物的抑菌活性具有較好的熱穩定性但隨著pH的增大，抑菌性能迅速降低。

[1]何順昌.革胡子鯰池塘精養高產技術[J].中國水產，2009(2):34-35

[2]周潤健.新技術使鯰魚產量提高近40倍 [N].中國食品質量報，2006-5-23(4)

[3]Yang H,Wang Y,Jiang M,et al.2-step optimization of the extraction and subsequent physical properties of channel catfish（Ictalurus punctatus）skin gelatin[J].Journal of Food Science，2007，72(4):188-195

[4]Ren X,Ma L,Chu J,et al.&An,H.Optimization of enzymatic hydrolysis of channel catfish bones for preparing antibacterial agents[J].Journal of Aquatic Food Product Technology,accepted,in press