木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白工藝條件的優化

張曉旭 ，趙國琦 ，*，錢利純 ，曹崇海

（1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.浙江大學飼料科學研究所，浙江 杭州 310029）

木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白工藝條件的優化

張曉旭1，趙國琦1，*，錢利純2，曹崇海2

（1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.浙江大學飼料科學研究所，浙江 杭州 310029）

對木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的工藝條件進行優化，探討了酶量、溫度、pH、酶解時間對木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的影響，運用二次回歸正交旋轉組合設計法，對四因素進行研究，確定了木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的最優酶解參數。實驗表明四因素對甲魚蛋白水解度的影響大小依次為：酶用量＞pH＞時間＞溫度，木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的最佳酶解工藝條件為：酶用量14350.77 U/kg，反應溫度69℃，pH 7.30，反應時間7 h。在此優化工藝條件下甲魚蛋白的水解度可達19.53%。

木瓜蛋白酶；甲魚蛋白；二次回歸正交旋轉組合設計；優化

甲魚，又稱鱉、團魚，是一種珍貴的水生經濟動物，自古以來就被視為食療滋補的佳品，其肉質鮮嫩味美，且富含豐富的蛋白質、鈣、磷、鐵、硫胺素、核黃素及尼克酸等營養成分，具有很高的營養價值及藥用價值[1-4]。近年來，隨著人工養殖技術的快速發展，甲魚市場出現了供大于求的現象，只有將甲魚經過科學的加工處理，提取其有效成分，制成易消化吸收、即食性強的營養保健食品，才能提高甲魚的利用率及消費量，并使甲魚的保健作用得到充分發揮[5]。其中甲魚的酶解技術是甲魚食品生產的關鍵技術[6]。由于酸法水解和堿法水解條件比較劇烈，對甲魚的營養成分破壞很大，同時水解產物的口感和風味不佳。而酶法酶解條件溫和，效率高，酶解后營養成分損失少[7],徐懷德[8]報道甲魚木瓜蛋白酶酶解產物的抗氧化性最好，因此在本試驗中我們選用木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白。

本實驗采用二次回歸正交旋轉組合設計對木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的工藝參數進行優化，確定木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的最佳水解條件，為甲魚深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲魚由杭州中得實業有限公司提供；木瓜蛋白酶（360000 U/g）由廣西南寧龐博生物工程有限公司提供。

DK-8D型電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；Centrifuge 5804R型高速冷凍離心機：eppendorf，德國生產；雷磁PHS-3C型pH計：上海精科雷磁儀器廠；AG 204型分析天平:METTLETOLEDO,瑞士生產；T6-新悅可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；J-6型多頭磁力加熱攪拌器：江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；JJ-2B組織勻漿機：金壇市精達儀器制造廠；微量凱氏定氮儀。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

甲魚→宰殺→熱燙去皮膜（95℃,10 s～15 s）→去內臟→去脂肪→高壓蒸煮→去骨→勻漿（按質量體積比1:10）→制成勻漿液→測勻漿液中總氮含量→在不同酶解條件下酶解→滅酶（95℃,15 min）→4000 r/min，離心5 min→測酶解液中氨基態氮含量

1.2.2 酶活的測定

采用紫外可見分光光度計法測定[9]。

酶活力的定義：1 min內水解標準酪蛋白釋放出的三氯乙酸可溶物在275 mm處的吸光度與1 μg酪氨酸相當時所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.2.3 總氮含量的測定

采用凱氏定氮法（GB/T 6432-1994）測定。

1.2.4 氨基態氮含量的測定

采用甲醛滴定法[10]測定。

1.2.5 水解度的測定

水解度=氨基氮/總氮×100%

1.2.6 試驗設計

1.2.6.1 單因素試驗設計

分別研究酶量（6000、9000、12000、15000、18000 U/kg）、溫度（50、55、60、65、70 ℃）、pH（6、6.5、7、7.5、8）、時間（5、6、7、8、9 h）對木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白參數的影響。

1.2.6.2 二次回歸正交旋轉組合設計

根據單因素試驗的結果分析確定各因素水平范圍，取單因子試驗中效果較好的參數作為各因素的零水平進行四元五次回歸正交旋轉組合試驗設計[11-13]，參試因子的水平設置及編碼見表1。影響模型的建立是根據系統分析的觀點采用四因子（1/2實施）二次正交旋轉回歸組合設計表2。每一參試因子的水平編碼為-1.682，-1，0，1，1.682，整個實驗設 23 個組合，依各組條件操作，測得各組氨基態氮含量，計算出相應的水解度。然后用SAS數據處理系統對試驗數據進行分析，從而確定木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的最佳酶解方案。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶量對酶解效果的影響

設定底物濃度為10%，酶解溫度為45℃，pH為7，酶解時間為 6 h，分別添加 6000、9000、12000、15000、18000 U/kg的酶量，來研究木瓜蛋白酶的用量對酶解效果的影響，結果見圖1。

圖1 酶量對水解度的影響Fig.1 Effects of dosage of enzyme on DH

由圖1可見，甲魚蛋白的水解度隨著酶用量的增加而增大。考慮到酶解的成本，木瓜蛋白酶的用量在9000 U/kg～15000 U/kg均可達到較理想的水解效果。

2.1.2 溫度對酶解效果的影響

設定酶解時木瓜蛋白酶的用量為9000 U/kg，在底物濃度為10%，pH為7，酶解時間為6 h的條件下，分別設定酶解溫度為 50、55、60、65、70 ℃來研究溫度對酶解效果，結果見圖2。

圖2 溫度對水解度的影響Fig.2 Effects of temperature on DH

由圖2可以看出，當溫度50℃～65℃范圍時，隨著溫度的升高，水解度有所提高，當溫度高于65℃時，水解度反而下降，這是由于溫度過高導致酶或者蛋白質的變性，不利于水解的進行。木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的溫度在60℃～70℃之間水解效果較為理想。

2.1.3 pH對酶解效果的影響

設定底物濃度為10%，酶量為9000 U/kg，酶解溫度為 45℃，酶解時間為 6 h，pH 在 6、6.5、7、7.5、8之間變動，所得結果如圖3所示。

由pH對酶解效果的影響圖可以看出，在pH為7.5時木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的水解度達到最高，當酶解液pH>7.5時，水解度下降，這可能與堿性環境使木瓜蛋白酶變性失活有關。

圖3 pH對水解度的影響Fig.3 Effects of pH on DH

2.1.4 時間對酶解效果的影響

設定底物濃度為10%，酶量為9000 U/kg，酶解溫度為 45 ℃，pH 為 7,考察酶解 5、6、7、8、9 h 對酶解效果的影響，結果見圖4。

圖4 時間對水解度的影響Fig.4 Effects of time on DH

如圖4所示，起初隨著水解時間增加，水解度不斷增大，當水解的時間達到8 h后，繼續延長水解時間，水解度基本保持不變，這說明8 h時，酶與底物的結合已基本達到飽和，繼續延長作用時間對酶解效果已沒有影響，因此木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的最佳反應時間為8 h。

2.1.5 小結

經過單因素試驗，水解效果較好的參數為：酶量9000 U/kg～15000 U/kg,溫度 60 ℃～70 ℃，pH 7.5,反應時間為8 h。

2.2 二次旋轉正文試驗結果與統計分析

根據單因素試驗結果，選擇優化因子的上下限范圍，得到因素水平編碼表（表1），試驗結果見表2。

2.2.1 數學模型的建立

用Microsoft Execl對二次回歸旋轉組合試驗統計方法對表2試驗結果進行擬合，得到水解度的回歸方程：

表1 因素水平編碼表Table 1 Code table of factor level

表2 二次回歸旋轉組合設計及試驗結果Table 2 Design and results of quadric regression orthogonal rotational experiment

2.2.2 模型顯著性檢驗

為檢驗回歸方程的有效性，對試驗結果進行方差分析，按 F失擬=失擬均方/誤差均方、F回歸=回歸均方/剩余均方進行顯著性檢驗，結果見表3。由表3可知，F失擬＝4.5173＜F0.05（2，6），失擬項在 α=0.05 水平上不顯著（P>0.05），表明模型擬合是合適的；F回歸=5.6560＞F0.01（14，8），達極顯著水平（P＜0.01），說明回歸方程是極顯著的。

甲魚蛋白的水解度與酶用量、溫度、pH以及作用時間的相關系數R2=回歸平方和/總平方和=90.82%，表明該數學模型4個因素對產量的影響占90.82%，而其它因素的影響和誤差僅占9.18%。

對回歸系數顯著性檢驗，在α=0.10顯著水平剔除不顯著項后，得到優化后的方程為：

表3 水解度試驗結果方差分析表Table 3 Variance analysis of experimental results

2.2.3 交互效應分析

通過對回歸方程的分析可知，酶用量與溫度、pH以及時間之間存在拮抗作用；而溫度與pH以及時間之間存在協同作用。

2.2.4 蛋白質水解度主要因素效應分析

用“降維法”將任意3個因素固定在零水平，得到另一個因素與水解度的效應方程：

根據回歸系數（絕對值）可知4個因素對甲魚蛋白水解度（%）的影響順序為：酶用量（X1）＞pH 值（X3）＞時間（X4）＞溫度（X2）。

2.2.5 最佳酶解方案

用SAS數據處理系統對試驗數據進行分析，求得甲魚蛋白水解的最佳酶解方案為：酶用量在1.318水平（14350.77 U/kg），作用溫度在 1.318水平（69℃），pH在-0.682水平（7.30），作用時間在-1.682水平（7 h）。此酶解方案得出的甲魚蛋白的最佳水解度可達19.53%。

3 討論

二次回歸正交旋轉組合設計是一種具有正交、回歸、均勻和較高飽和程度的一種試驗設計方法，屬更高級的試驗設計技術。它具有兩個顯著的優點：一、基本保留了回歸正交設計試驗次數少、計算簡單以及部分地消除了回歸系數間的相關性的優點；二、克服了在回歸正交設計中二次回歸預測值的方差依賴于試驗點在因子空間中位置的缺點[14]。本試驗通過二次回歸正交旋轉組合設計得到木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的最佳酶解工藝參數，通過此酶解方案得出的甲魚蛋白的最佳水解度可達19.53%，其結果顯著高于殷金蓮[15]等的報道。

本次試驗中使用改進的氨基態氮的測定方法，借助精密pH計，能避免雙指示劑甲醛滴定法測定時，由眼睛色差所引起的的誤差。試驗結果說明，甲魚原料處理的差異、試驗方法的不同以及甲魚品種之間的差異，均會對試驗結果產生影響。

另外在酶解蛋白質的過程中能夠獲得許多功能多肽，這些多肽對于我國生物醫藥和保健制品的開發，以及提高人類的健康水平具有重要意義[16-18]。Suetsuna-K[19]等利用酶水解沙丁魚，從中得到抗氧化肽，徐懷德[20]對木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白酶解產物進行體外ACE抑制和抗氧化活性研究，證實甲魚多臺具有較強的體外ACE抑制活性和抗氧化活性。本試驗只是對木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的參數進行了優化，兩種或3種酶結合水解的效果是否會更好[21]，以及甲魚酶解液的產品開發和產品的功能性等，目前還存在爭議，有待進一步的研究。

4 結論

通過運用二次回歸旋轉組合試驗統計方法對單因素試驗結果進行擬合，建立了甲魚蛋白的水解度對酶用量、酶解溫度、pH及酶解時間4個試驗因素的正交回歸模型，得出了木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白的最佳酶解工藝條件。試驗結果表明，在pH 7.30，溫度69℃的條件下，用14350.77 U/kg的木瓜蛋白酶水解甲魚蛋白7 h，甲魚蛋白的水解度最高可達19.53%。

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The Optimal Parameters for Turtle Protein Enzymatic Hydrolysis by Papain

ZHANG Xiao-xu1,ZHAO Guo-qi1,*,QIAN Li-chun2,CAO Chong-hai2

（1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，Jiangsu,China；2.Feed Science Institute，Zhejiang University，Hangzhou 310029，Zhejiang,China）

Four single-factors（enzyme concentration,temperature,pH and time）for turtle protein enzymatic hydrolysis by papain were studied in this paper.By means of quadratic regression rotational combinational design,effect of four factors on the degree of hydrolysis of turtle protein were studied,a mathematical model of protein hydrolysis was established and an optimum parameters for turtle protein enzymatic hydrolysis.According to their influence on the yield of protein hydrolysis,the result showed that the ranking of the factors was enzyme concentration>pH>time>temperature.The optimum parameters for turtle protein enzymatic hydrolysis by papain was as following:the enzyme concentration 14350.77 U/kg,temperature 69℃,pH 7.30 and time 7 h.Under such condition,the degree of hydrolysis can come up to 19.53%.

papain;turtle protein;quadratic regression rotational combinational design;optimization

浙江省重大科技專項（2008C12023-2）

張曉旭（1983—），女（漢），碩士，研究方向：動物微生態營養與分子營養。

*通信作者：趙國琦，男，教授（博導），博士，研究方向：動物微生態營養與分子營養。

2010-08-01