豬膽汁中鵝去氧膽酸提取工藝的研究

曹榮安 ，李良玉 ，張麗萍 ，*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

豬膽汁中鵝去氧膽酸提取工藝的研究

曹榮安1，李良玉2，張麗萍1，*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

以提取出膽紅素的豬膽粉為原料，研究了反應(yīng)溫度、pH、CaCl2添加量、反應(yīng)時(shí)間對CDCA純度的影響，實(shí)驗(yàn)顯示：反應(yīng)溫度為45℃、樣品pH為10.5、CaCl2添加量為樣品質(zhì)量的10%、反應(yīng)時(shí)間為2h，鵝去氧膽酸純度達(dá)到47.05%。

豬膽汁；鵝去氧膽酸；提取

鵝去氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA），又稱3α，7α-二羥基-5β-膽烷酸，是動(dòng)物體膽汁中的一種生化物質(zhì)。CDCA為無色針狀結(jié)晶，無臭、味苦，幾乎不溶于水，易溶于乙醇、冰乙酸、微溶于氯仿[1-3]，在臨床上主要用于治療膽結(jié)石癥，尤其對膽固醇膽結(jié)石有很好的溶解作用，還具有顯著的平喘、抗炎、鎮(zhèn)咳和祛痰作用。本研究采用膽紅素和膽酸聯(lián)產(chǎn)工藝方案，以膽汁提取膽紅素生產(chǎn)過程中的濾去膽鈣鹽的母液為原料，采用CaCl2為沉淀劑進(jìn)行鵝去氧膽酸提取工藝研究[4-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

新鮮豬膽：采購自大慶金鑼公司；鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；氫氧化鈉、氯化鈣、鹽酸、乙酸乙酯、氨水：均為分析純，沈陽市華東化學(xué)試劑廠。

1.1.2 主要儀器

恒溫水浴箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MD100-2電子分析天平：沈陽華騰電子有限公司；烘干箱：天津市泰斯特儀器有限公司；島津UV－260紫外分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 豬膽汁預(yù)處理

豬膽汁提取膽紅素后剩余的母液烘干成膽粉[9-11]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方案

膽粉→加水→15%NaOH調(diào)pH→加氯化鈣→水洗沉淀→清液加鹽酸調(diào)pH→水洗沉淀至中性→烘干→鵝去氧膽酸粗品

1.2.3 CDCA的測定[12-15]

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取CDCA標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加入60%醋酸定容，搖勻，精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置帶塞試管中，用60%醋酸溶液稀釋1.0 mL，加1%糠醛溶液1 mL，在冰浴中放置5 min，加硫酸溶液[V（H2SO4）:V（H2O）=50:65]13 mL 混勻，在70℃水浴中加熱10 min迅速移至冰浴中放置2 min取出，以相應(yīng)試劑為空白，在380 nm波長處紫外分光光度計(jì)測定吸光度，根據(jù)吸光光度值繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并計(jì)算R2值。CDCA測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。

圖1 鵝去氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of CDCA determination

1.2.3.2 粗品CDCA的測定

精密稱取樣品12.5 mg，加60%醋酸液適量，充分?jǐn)嚢瑁迫?5 mL容量瓶中，殘?jiān)儆?0%醋酸液攪拌，全部移入容量瓶中并稀釋至25 mL，精密量取溶液1 mL，置于試管中加1%糠醛液1 mL，在冰浴中放置5 min，加[V（H2SO4）:V（H2O）=50:65]硫酸溶液 13 mL 混勻，在70℃水浴中加熱10 min，迅速移至冰浴中放置2 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，紫外分光光度計(jì)在380 nm波長處測定吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算樣品中CDCA的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)溫度對CDCA純度的影響

準(zhǔn)確稱取5份10 g膽粉加50 mL蒸餾水，用15%的NaOH調(diào)pH至10.5，CaCl2添加量為10%，設(shè)置反應(yīng)溫度為 35、40、45、50、55 ℃ 5 個(gè)水平，反應(yīng)時(shí)間 1 h，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行水洗、調(diào)pH和烘干處理。測定膽粉中CDCA的含量，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出水浴溫度與CDCA純度的關(guān)系圖，見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度與鵝去氧膽酸純度關(guān)系圖Fig.2 The relation between different temperature and the purity of CDCA

由圖2可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高CDCA純度顯著提高（p＜0.05），當(dāng)溫度為45℃時(shí)CDCA純度最高。這是由于溫度在低于45℃時(shí)，反應(yīng)不完全；溫度高于45℃時(shí)可能是分子運(yùn)動(dòng)過于活躍，不容易形成膽酸鈣鹽，因此選擇40、45、50℃為提取CDCA的最佳反應(yīng)溫度。

2.2 樣品pH對CDCA純度的影響

準(zhǔn)確稱取5份10 g膽粉加50 mL蒸餾水，用15%的 NaOH 分別把樣品 pH 調(diào)至 8.5、9.5、10.5、11.5、12.55個(gè)水平，CaCl2添加量為10%，50℃水浴1 h，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行水洗、調(diào)pH和烘干處理。測定膽粉中CDCA的含量，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出樣品pH與CDCA純度的關(guān)系圖，見圖3。

圖3 樣品pH與鵝去氧膽酸純度關(guān)系圖Fig.3 The relation between different pH and the purity of CDCA

由圖3可以看出，隨著pH值的增加CDCA的純度顯著提高（p＜0.05），在pH為10.5時(shí)CDCA純度最高，之后隨著pH的增加CDCD純度顯著降低（p＜0.05）。這是由于膽酸在堿性條件溶解度較大，隨著pH的升高溶解度逐漸增加，但在pH達(dá)到10.5后膽酸分子遭到破壞使膽酸含量降低。因此9.5、10.5、11.5為提取CDCA的最佳pH。

2.3 CaCl2添加量對CDCA純度的影響

準(zhǔn)確稱取5份10 g膽粉加50 mL蒸餾水，用15%的NaOH調(diào)pH至10.5，CaCl2添加量為6%、8%、10%、12%、14%5個(gè)水平，在50℃下水浴處理時(shí)間1 h，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行水洗、調(diào)pH和烘干處理。測定膽粉中CDCA的含量，繪制出CaCl2添加量與CDCA純度的關(guān)系圖，見圖4。

由圖4可以看出，添加量為6%～8%時(shí)CDCA純度顯著提高（p＜0.05），10%時(shí) CDCA 的純度最高，添加量高于12%純度提高趨于平緩，差異不顯著（p＞0.05）。因此，添加8%、10%、12%時(shí)為提取CDCA的CaCl2最佳添加量。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對CDCA純度的影響

圖4 氯化鈣添加量與鵝去氧膽酸純度的關(guān)系圖Fig.4 The relation between CaCl2and the purity of CDCA

準(zhǔn)確稱取5份10 g膽粉加50 mL蒸餾水，用15%的NaOH調(diào)pH至10.5，CaCl2添加量為10%，水浴溫度為 50 ℃，分別選擇反應(yīng)時(shí)間為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行水洗、調(diào)pH和烘干處理。測定膽粉中CDCA的含量，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出反應(yīng)時(shí)間與CDCA純度的關(guān)系曲線圖，見圖5。

圖5 氯化鈣反應(yīng)時(shí)間與鵝去氧膽酸純度的關(guān)系圖Fig.5 The relation between different time and the purity of CDCA

由圖5可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加CDCA純度顯著提高（p＜0.05），反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)CDCA純度最高，之后隨著反應(yīng)時(shí)間的增加CDCA純度顯著下降（p＜0.05）。反應(yīng)時(shí)間小于2 h時(shí)，反應(yīng)不完全；反應(yīng)時(shí)間大于2 h時(shí)，由于時(shí)間過長使膽酸分子遭到破壞，CDCA純度降低。因此2 h為提取CDCA的最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.5 CDCA提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 The table of factor levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Scheme and results of regression orthogonal rotary design

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見表3，結(jié)果顯示：A因素F值為47.330，大于在0.05水平上的F統(tǒng)計(jì)量的值，因此因素A（反應(yīng)溫度）對試驗(yàn)的影響顯著（p＜0.05）；B因素F值為99.256，大于在0.01水平上的F統(tǒng)計(jì)量的值，因此因素B（樣品pH）對試驗(yàn)的影響極顯著（p＜0.01）；D 因素 F值為23.448，大于在 0.05水平上的F統(tǒng)計(jì)量的值，因此因素D（反應(yīng)時(shí)間）對試驗(yàn)的影響顯著（p＜0.05）。為確定最佳的工藝參數(shù)對因素A、B、D進(jìn)行多重比較，見表4～表7。

表3 方差分析表Table 3 The table of ANOVA

表4 多重比較SSR及LSR值表Table 4 The SSR and LSR of multiple comparison

表5 反應(yīng)溫度多重比較Table 5 The multiple comparison of temperature

由表5可以看出，A因素K2-K3=6.050＞LSR0.05=4.0876，所以 A2，A3差異顯著，因此 A2最好。

表6 樣品pH多重比較Table 6 The multiple comparison of pH

由表6可以看出，B因素K2-K3=10.99＞LSR0.01=9.3970，所以 B2，B1差異顯著，因此 B2最好。

表7 反應(yīng)時(shí)間因素多重比較Table 7 The multiple comparison of time

由表7可以看出，B因素K2-K3=5.930＞LSR0.05=4.0876，所以 D2，D3差異顯著，因此 D2最好。

由于C因素對試驗(yàn)影響較小，所以選擇低能耗的C1（8%）。經(jīng)多重比較分析后，最佳的工藝參數(shù)為A2B2C1D2，即為：反應(yīng)溫度為50℃，樣品pH為10.5，CaCl2添加量為8%，反應(yīng)時(shí)間為2.0 h。用正交試驗(yàn)得出的最佳工藝參數(shù)A2B2C1D2作驗(yàn)證試驗(yàn)，設(shè)平行樣3組，以提取率為指標(biāo)，結(jié)果顯CDCA的平均純度為47.05%，且重復(fù)實(shí)驗(yàn)相對偏差不超過2%，說明試驗(yàn)條件重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

通過以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，在單因素的基礎(chǔ)上以CDCA純度為指標(biāo)，對反應(yīng)溫度、pH、CaCl2添加量、反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行L9（43）正交試驗(yàn)。確定出最佳提取條件：反應(yīng)溫度為45℃，樣品pH為10.5，CaCl2添加量為8%，反應(yīng)時(shí)間為2.0 h，純度達(dá)到47.05%。

采用CaCl2為沉淀劑提取CDCA的方法研究豬膽汁中CDCA的提取工藝，通過正交試驗(yàn)得到了最佳的提取工藝條件，為對動(dòng)物膽汁進(jìn)行提取純化及加工生產(chǎn)開辟了一條新的切實(shí)可行的途徑；其工藝簡單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)；同時(shí)也達(dá)到了進(jìn)一步提高畜禽副產(chǎn)物附加值的作用。

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Study on the Extraction Technology of Chenodeoxycholic Acid from Porcine Bile

CAO Rong-an1，LI Liang-yu2，ZHANG Li-ping1，*

（1.Heilongjiang August First Agricultural Reclamation University Food College，Daqing 163319,Heilongjiang，China；2.HLJ Agricultural Food Process Engineering and Technological Research Center，Daqing 163319,Heilongjiang，China）

This experimental uses the production which is extracted bilirubin,selects temperature,pH,concentration of CaCl2and time as the factors.The result shows that the optimal extraction method is temperature 45℃,pH 10.5,concentration of CaCl210%,time 2 h.The purity of CDCA is 47.05%.

porcine bile；CDCA；extraction

黑龍江省農(nóng)墾總局《大鵝系列快餐化食品及其副產(chǎn)物綜合利用技術(shù)研究》（HNKXIV-08-11）

曹榮安（1980—），男（漢），講師，碩士，研究方向：畜產(chǎn)品加工。*通信作者

2010-08-06