低溫提取南瓜多糖的理化性質及清除DPPH自由基作用

于斐，李全宏

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

低溫提取南瓜多糖的理化性質及清除DPPH自由基作用

于斐，李全宏*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

首次采用低溫水提的方法對南瓜多糖進行提取，從得率、理化性質、清除DPPH自由基活性方面對低溫提取的南瓜多糖進行了研究，并與高溫提取的南瓜多糖進行了比較。實驗結果表明：經緩凍處理后，室溫提取的南瓜多糖得率為5.06%，低于70℃提取的多糖得率5.48%（P>0.05）。低溫提取的南瓜多糖為白色粉末，I2-KI反應陰性，分子量分布主要為4 ku～270 ku；低溫南瓜多糖清除DPPH自由基的效果明顯高于高溫提取的南瓜多糖（P<0.05）。

南瓜；多糖；低溫；性質；DPPH自由基

活性多糖是多糖中具有生物生理活性和特殊保健功能的一類物質。20世紀50年代，日本科學家首次發現香菇中存在能抗輻射和抑制腫瘤生長甚至使腫瘤縮小的物質，后證實這種物質是香菇多糖[1]。隨后，國內外科學家掀起了一股研究開發活性多糖的熱潮 ，目前國內外報道活性多糖的藥理功能有：增強免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗突變、抗輻射、抗病毒、降血糖、降血脂等[2]。目前南瓜多糖多采用熱水浸提的方法獲得，張擁軍等采用60℃～100℃熱水提取[3]，孔慶勝等采用了甲醇回流，煮沸6 h來提取[4]。根據研究報道，很多天然物質在高溫時，易受到破壞，使其生物活性降低或喪失。但是多糖的結構和功能會不會受到高溫的影響，低溫提取的南瓜多糖（LTPP）與高溫提取的南瓜多糖（HTPP）有什么差異，目前尚鮮見文獻報道。因此，本課題就低溫提取的南瓜多糖的性質進行了研究，并將其與高溫提取的南瓜多糖的性質進行了比較。這一研究為活性多糖的研究提供了新的方向，也為今后的研究奠定了理論基礎。

根據文獻報道[5-6]，緩凍能明顯提高南瓜多糖提取得率，尤其是緩凍的效果更為明顯，為了準確、高效的提取分離到南瓜多糖的功能性成分，在實驗中采用緩凍強化，低溫提取的方法提取南瓜粗多糖。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜：購于市場；DPPH、葡聚糖標準品：sigma公司；透析袋MW3500：美國；其他試劑均為分析純：購于國藥集團。

TGL-16A臺式高速冷凍離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司；2802紫外可見分光光度計：尤尼科（上海儀器有限公司；液相：德國KNUAER公司；RE-52A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 南瓜多糖的提取[7]

準確稱取緩凍后的南瓜100 g，切塊，打磨成漿，以料液比 1:4（g:mL）加入去離子水，浸提一定時間，4 層絹布過濾，收集濾液，45℃旋轉蒸發至原體積的1/2。濃縮液即為南瓜多糖提取液。

1.2.2 脫蛋白

采用 Sevag 法進行。按多糖:氯仿:正丁醇=15:4:1的比例（體積比）振蕩混，4000 r/min離心分離，反復進行多次，直至無白色沉淀為止。

1.2.3 醇沉

將無水乙醇緩慢加入到濃縮后的多糖溶液中，乙醇終濃度為75%，于4℃冰箱中醇沉12 h，4200 r/min離心20 min，收集沉淀，即得南瓜多糖。

1.2.4 透析

將樣品溶液裝入透析袋中，于去離子水中透析72h，以去除離子、小分子物質和多肽。

1.2.5 冷凍干燥

將透析液液進行凍干,最后得白色粉狀南瓜多糖粗品。

1.3 測定方法

1.3.1 多糖含量測定[8-9]

采用硫酸-苯酚法進行測定。

1.3.2 蛋白質含量測定[8-9]

采用Folin-酚法進行測定。

1.3.3 還原糖含量測定[10]

DNS法。

1.3.4 平均聚合度測定[11]

平均聚合度=總糖含量/還原糖含量。

1.4 理化性質分析

1.4.1 Molish反應[12]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于試管中,加入2滴5%α-萘酚-乙醇溶液,揺勻,將試管傾斜,沿試管壁緩緩加入1 mL濃硫酸，豎直試管，觀察濃硫酸和糖交界面顏色的變化。以純水作陰性對照,淀粉溶液（1 mg/mL）作陽性對照。

1.4.2 硫酸-蒽酮反應[12]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于試管中，加入新配制的蒽酮試劑。搖勻，于沸水浴中加熱10 min，取出冷至室溫，觀察顏色變化。對照同1.4.1。

1.4.3 碘-碘化鉀反應[13]

取1 mL南瓜多糖溶液（1 mg/mL）置于試管中，加入I2-KI溶液，觀察顏色變化。對照同1.4.1。

1.4.4 分子量測定

色譜條件：Shodex SB-805 HQ，流動相0.1 mol/L NaNO3，流速 0.5 mL/min，柱溫 35 ℃。

標準曲線的制作：取適量葡聚糖標準品T5、T12、T25、T50、T270、T670溶于純水。可得分子量與出峰時間的關系。

樣品測定方法同上。

1.5 DPPH自由基清除作用的測定[14]

取一定濃度的糖溶液1.5 mL，加入0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液3 mL，混勻后，25℃靜置20 min后在517 nm處測吸光度值。以蒸餾水代替樣品作為空白，以酒精溶液代替DPPH-乙醇溶液作為對照。

DPPH 自由基清除率=[1-（Asample-Acontrol)/Ablank]×100%

2 結果與討論

2.1 南瓜多糖得率

不同提取條件對南瓜多糖得率的影響見圖1。

圖1 不同提取條件下南瓜多糖的得率Fig.1 The yield of pumpkin polysaccharides at different conditions

由圖1可知，緩凍后南瓜多糖的得率明顯高于未緩凍的樣品，這是由于緩凍過程中破壞了南瓜的細胞壁，更有利于多糖的溶出。高溫也可以使南瓜細胞“崩解”促進多糖的溶出。緩凍和高溫都可以起到破壁的作用，因此HTPP的得率雖然高于LTPP的得率，但是并沒有顯著的差別，而且隨著時間的延長，高溫提取的南瓜多糖的得率反而降低，可能是高溫條件破壞了某些糖類的結構。因此，LTPP選擇25℃，提取6 h；HTPP選擇70℃提取4 h。

2.2 南瓜多糖的理化性質

南瓜多糖的理化性質見表1。

表1 南瓜多糖的理化性質Table 1 The Physicochemical properties of polysaccharide

南瓜多糖為白色粉末，溶于水，由表1可知，Molish反應呈陽性，硫酸-蒽酮反應呈陽性，說明提取物為多糖，I2-KI反應呈陰性，說明為非淀粉性多糖。Sevag法可以脫除游離蛋白，經脫蛋白后LTPP的蛋白含量明顯高于HTPP，這可能是由于LTPP含有較多的南瓜糖蛋白復合物，從而使兩者的功能性質產生差異。根據平均聚合度和分子量分布圖，可知LTPP的分子量要低于HTPP，尤其是高分子量組分比較低。這也解釋了LTPP溶解度較高的原因。

多糖標品的分布如圖2所示，根據圖2計算得多糖分子量分布的標準曲線：logM=-0.5501x+14794 R2=0.9878。根據樣品的出峰時間，即可計算出樣品的分子量分布范圍，LTPP和HTPP的分子量見圖3，計算可得，LTPP的分子量范圍為：4 ku～270 ku；HTPP的分子量范圍為：4 ku～270 ku。

圖2 多糖標品的分子量分布圖Fig.2 The molecular weight distribution of polysaccharide standard

2.3 清除DPPH自由基的作用

DPPH自由基是一種比較穩定的自由基，與其他自由基評價抗氧化的方法相比，DPPH自由基方法能夠快速的反應樣品的抗氧化活性。南瓜多糖對DPPH自由基的清除作用見圖4。

圖3 南瓜多糖的分子量分布圖Fig.3 The molecular weight distribution of pumpkin polysaccharide

圖4 南瓜多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.4 The DPPH radical scavenging activity of punpkin polysaccharide

由圖4可知，南瓜多糖對DPPH自由基有明顯地清除作用，清除率和多糖的含量存在著一定的量效關系。這可能與南瓜多糖分子中的還原性的半縮醛羥基有關。南瓜多糖在2 mg/mL～5 mg/mL的范圍能夠有效的清除DPPH自由基，達到50%清除率需要LTPP的量為3.6 mg/mL。LTPP對DPPH自由基的清除作用要好于HTPP，尤其是在濃度增大時。其它抗氧化活性實驗以及其抗氧化機制還需要進一步研究。

3 結論

本文對低溫提取南瓜多糖的性質進行了研究，LTPP為白色粉末，主要為分子量分布范圍為4 ku～270 ku的非淀粉多糖。緩凍處理可以有效提高南瓜多糖得率，而且低溫提取可以節約大量能源，降低生產成本，實現環保生產。對南瓜多糖抗氧化的初步研究表明南瓜多糖具有良好的DPPH自由基清除作用，但對南瓜多糖的其他功能活性，尤其是高純度的LTPP的藥理作用，目前尚需進一步研究，為開發保健品和高附加值的工業化南瓜產品，提供理論依據。

[1]H-D Bellitz,W Grosch,P Schieberle.食品化學[M].3 版.北京:中國農業大學出版社：92-112

[2]李延華.果蔬中多糖功能因子的研究概況及開發利用[J].北方園藝,2008(12):75-77

[3]張擁軍,姚惠源.南瓜多糖的分離、純化及其降血糖作用[J].中國糧油學報,2002,17(4):59-62

[4]孔慶勝，蔣瀅.南瓜多糖的分離純化及其降支鏈氨基酸作用[J].濟寧醫學院學報,2002,35(1):29-31

[5]向東.南瓜多糖的提取及研究[D].廣東：華南理工大學,2004：11-12

[6]付才力.南瓜糖肽和木葡聚糖的分離純化及其功能研究[D].北京：中國農業大學,2006：13-14

[7]孔倩,周婷,武改蘭，等.南瓜水溶性多糖的制備及硫酸酯化初步研究[J].食品科學，2009,30(16):73-77

[8]韓雅珊.食品化學實驗指導[M].北京:中國農業大學出版社,1996：34-37

[9]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].浙江:浙江大學出版社,1999:10-12

[10]WichienchotS，JatupornpipatM，RastallRA，etal.Oligosaccharides of pitaya(dragon fruit)flesh and their prebiotic properties[J].Food chemistry，2010，120(3)：850-857

[11]I Defloor,V Vandenreyken,P J Grobet，et al.Fractionation of maltodextrins by ethanol[J].Journal of Chromatography A，1998(803):103-109

[12]李軍,蔣碧蓉,王海妹，等.海星多糖的分離純化及鑒定[J].食品工業科技，2010(2):121-124

[13]孟慶勇,劉志輝,徐美奕，等.半葉馬尾藻多糖的提取和分析[J].光譜學與光譜分析，2004,24(12):1560-1562

[14]Bao Yang,Mouming Zhao,K Nagendra Prasad,et al.Effect of methylation on the structure and radical scavenging activity of polysaccharides from longan(Dimocarpus longan Lour.)fruit pericarp[J].Food Chemistry,2010(118):364-368

The Physicochemical Properties and Radical Scavenging Activity of Pumpkin Polysaccharides Extracted at Low Temperature

YU Fei,LI Quan-hong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

Crude water-soluble pumpkin polysaccharides were extracted from pumpkin pulp at room temperature（25 ℃）.The yield,physicochemical properties and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides were studied and compared with which obtained at 70℃.The results indicated that after slow freezing treatment,the yield of polysaccharides extracted at 25℃ was 5.06%and that extracted at 70℃ was 5.48%.Their difference was not obviously.The pumpkin polysaccharides obtained at 25℃were white in colour,non-strach,and molecular weight ranged from 4 ku to 270 ku.Moreover the DPPH radical scavenging activity was higher than the polysaccharide obtained at 70℃.

pumpkin；polysaccharide；low temperature；propery；DPPH radical

自然基金（3067146）

于斐（1986—），女（漢），碩士研究生，研究方向：果蔬加工。

*通信作者：李全宏（1966—），男，博士生導師，教授，研究方向：農產品加工與綜合利用。

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2010-08-31