改性處理對花生蛋白致敏性的影響

王爍 ，吳海文 ，邱志龍 ，汝海健 ，高美須 ，李淑榮 ，*

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工與質量控制重點開放實驗室，北京 100193；2.沈陽產品質量監督檢驗院，遼寧 沈陽 110022）

改性處理對花生蛋白致敏性的影響

王爍1，2，吳海文1，邱志龍2，汝海健2，高美須1，李淑榮1，*

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工與質量控制重點開放實驗室，北京 100193；2.沈陽產品質量監督檢驗院，遼寧 沈陽 110022）

通過檢測花生蛋白SDS-PAGE電泳及免疫印跡圖譜研究不同改性處理對花生蛋白致敏性的影響。結果表明，物理方法及化學方法雖然能降低一定的致敏性，但效率不高。經轉谷氨酰胺酶處理后63.2、53.2、47.4、41.6 ku的致敏蛋白含量及致敏性隨加酶量的增加而降低。

改性；花生；致敏蛋白

食物過敏是食品安全的重要研究內容之一，引起國內外食品安全專家的高度關注。花生作為我國重要的油料和經濟作物之一，是人們主要的食物來源和重要的食品加工原料。據報道花生過敏占食物過敏的10%～47%[1]，由于各民族的遺傳因素的差異和飲食習慣的不同，引起過敏反應的原因也有所不同。流行病學研究表明在美國約有0.6%的人群，英國約有0.5%的人群對花生過敏[2]。在中國，對96例過敏性皮炎的誘因分析發現，其中12.5%是由食物過敏引起的，而對32例進行體外IgE檢測發現6.3%對大豆/花生過敏[3]。但國內在花生致敏方面的研究較少，至今少有人做過系統的研究。

蛋白質改性是人為地對蛋白質結構進行修飾，從而改善產品的相容性和功能性。與蛋白質改性方法相類似，花生蛋白中過敏原的去除可根據原理不同，分為物理法、化學法、生化法、酶法、基因工程方法和育種學方法等，在食品領域中主要采用物理法、化學法和酶法。為保證花生制品的安全性，本研究采用的物理法主要涉及了加熱、機械作用、聲波、微波等方式，化學法主要是采用還原劑對蛋白進行結構修飾，酶法主要采用轉谷氨酰胺酶對蛋白進行改性處理。本文通過SDSPAGE電泳及Western Blot免疫印跡判斷致敏蛋白分布及致敏性的變化，探討花生致敏蛋白的物化性質，旨在獲得低致敏性的蛋白質，為花生脫敏方法的建立提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生濃縮蛋白：中國農業科學院農產品加工研究所，農業部輻照產品監督檢驗測試中心實驗室自制；花生過敏患者血清（7例，中國醫學科學院附屬北京協和醫院變態反應科）；轉谷氨酰胺酶：TGase，100 U/g，江蘇泰興一鳴生物制品有限公司。

AE-8130型電泳儀、AE-6450型垂直電泳槽、AE-6675&AE-6675L型轉移電泳槽：日本ATTO公司；KQ-200VDB型雙頻數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HMS-350小型旋渦振蕩器：天津市恒奧科技發展有限公司。

1.2 實驗設計

1.2.1 物理處理

1）熱處理

8%的花生濃縮蛋白溶液，80℃水浴6 min，冷卻至室溫，冷凍干燥。

2）高速攪拌

8%的花生濃縮蛋白溶液，12000 r/min攪拌60 s，冷凍干燥。

3）超聲輻射

8%的花生濃縮蛋白溶液，懸浮液置于超聲波發生器內，超聲儀探頭浸入液面2 cm，1000 W超聲6 min，冷凍干燥。

4）微波輻射

8%的花生濃縮蛋白溶液，功率800 W微波輻射30 s，冷凍干燥。

1.2.2 化學處理

1）還原劑-1處理

9.6 %的花生濃縮蛋白溶液（pH7.0）5 mL，加入1 mL 0.625 mmol/L的還原劑-1溶液，30℃振蕩90 min，冷凍干燥。

2）還原劑-2處理

9.6 %的花生濃縮蛋白溶液（pH7.0）5 mL加入試管中，加入1 mL 0.75 mmol/L的還原劑-2溶液，30℃振蕩120 min，冷凍干燥。

1.2.3 酶處理

花生濃縮蛋白溶于pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，配制成15%（g/mL）的溶液，攪拌2 h，每克蛋白質分別添加 1、2、3、4、5、7.15、8.75、12.5、16.25、18.81U轉谷氨酰胺酶，50℃反應1h，保鮮膜封口，90℃下處理15 min，流動水快速冷卻，4℃冰箱保存14 h[4]。

1.3 方法

1.3.1 花生濃縮蛋白的制備

以脫脂花生蛋白粉為原料，料液比1:11（g/mL），36℃85%乙醇浸提60 min；1500 r/min離心10 min；沉淀用8倍97.5%乙醇，38℃浸提30 min，1500 r/min離心10 min去除上清液，40℃鼓風干燥90 min，得花生濃縮蛋白（PPC）。

1.3.2 花生粉中蛋白的提取

花生粉2.0 g溶解于40 mL 0.01 mol/L pH7.2的PBS緩沖溶液中，振蕩提取2 h，于4℃離心（15000r/min,15 min），取上清液待用，即花生粉溶液。

1.3.3 酶處理后花生粉中蛋白的提取

酶處理后花生粉2.0 g，溶解于40 mL 0.01 mol/L pH8.8的Tris-HCl緩沖溶液中，振蕩2 h，9000 r/min 4℃離心20 min，取上清液待用。

1.3.4 酶活力測定

酶活力測定采用SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定法。

1.3.5 SDS-PAGE電泳

1）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDSPAGE），13.5%分離膠，5%濃縮膠。

2）將花生蛋白溶液與2×SDS樣品緩沖液混合，煮沸，離心數秒，靜置。

3）將處理過的樣品和標準分子量Marker用微量加樣器加到梳孔中。

4）120 V恒壓電泳，至溴酚藍前沿到達凝膠下邊界，停止電泳，取出凝膠，固定染色。

1.3.6 電轉移（半干式）

1）將硝酸纖維素膜作上標記，與SDS-PAGE凝膠的大小一樣。再將大小相同的6張濾紙每3張一組，分別浸泡在陽極及陰極電極緩沖液中。

2）將電泳完畢的SDS-PAGE凝膠取下，放入電轉緩沖液中平衡20 min～30 min。按以下順序鋪于陽極上：3層陽極濾紙→NC膜→凝膠→3層陰極濾紙，輕輕壓緊“凝膠三明治”，蓋上蓋子，降低并鎖定負極。

3）定流 96 mA/gel，電轉移 2.0 h。

4）電轉移結束后，NC膜用麗春紅溶液染色5 min，脫色5 min，觀察轉印效果及蛋白質位置，進行免疫印跡。

1.3.7 免疫印跡

1）轉印后的NC膜漂洗，封閉。

2）NC 膜與合適濃度的第一抗體（1:2.5～1:5）室溫下孵育過夜。

3）NC膜與合適濃度的HRP（辣根過氧化物酶）標記的鼠抗人IgE（酶標記過的1:200稀釋）于37℃孵育2 h。

4）漂洗后的NC膜浸沒在底物溶液中顯色，待蛋白帶顯色清晰，終止反應。

5）用去離子水沖凈NC膜，夾于雙層濾紙中風干保存。

1.3.8 SDS-PAGE及Western Blot結果分析

采用FlourChemV2.0凝膠成像分析軟件（America）分析。

7例血清與花生蛋白反應變化程度基本相同，僅以其中最為明顯一例進行說明。

2 結果與討論

2.1 物理處理對花生致敏蛋白的影響

物理及化學處理對花生致敏蛋白的影響見圖1。

圖1 物理及化學處理對花生致敏蛋白的影響Fig.1 Effect of physics and chemistry process on allergic proteins of peanut

從圖1中可看出，花生蛋白粉出現20余條深淺不一的蛋白區帶,分子量主要介于14.6 ku～96.9 ku之間。其中有10條帶蛋白含量較多,分子量分別為63.2、37.5、34.3、30、23.6、22.5、20.2、18.6、17.6 和 8.19 ku,又以 63.2、20.2、18.6、17.6 和 8.19 ku等 5個區帶蛋白含量最豐富。據報道，食物過敏原為具有酸性等電點的蛋白質或糖蛋白，分子量在10 ku～70 ku[5]。研究中發現有 63.2、53.2、47.4、41.6、39.3、34.3、30.0、23.6、20.2、18.6、17.6和14.6 ku,共12條蛋白帶的分子量與花生致敏蛋白相近[6]。

對于過敏原為蛋白質的食品，高溫處理會破壞蛋白質空間構象，進而會一定程度的降低食品的致敏性。例如，病人對凍干的蛋清蛋白過敏，卻對經過烹調的蛋清蛋白不過敏[7]。高速攪拌過程中，高速剪切作用使蛋白質大分子聚集體破碎，即打斷蛋白分子間的較弱的作用力，如氫鍵，范德華力等，同時增加原先包埋在分子內部的致敏基團的暴露機會，從而有可能改變花生蛋白的致敏性。此外，Ryo Nakamura[8]利用超聲波處理浸泡過的大米，結果去除了90%的致敏蛋白，而其他蛋白沒有明顯損失。超聲波在介質中傳播時，會產生熱效應，機械效應或空化效應，引起介質的一些特性發生改變。但從圖1可以看出，熱處理、高速攪拌、超聲輻射對花生致敏蛋白分子量及致敏性均無明顯影響，與Ryo Nakamura等研究的結論有所不同，這可能與原料有關。

由圖1可知，微波輻射未改變花生致敏蛋白的分子量分布，但明顯降低了63.2、30 ku蛋白的致敏性。微波能是一種由離子遷移和偶極子轉動而引起分子運動的非離子化輻射能，當它作用于分子時，可促進分子的轉化運動，產生鍵的振動、撕裂和粒子間的摩擦和碰撞，并迅速生成大量的熱能，促使分子間和分子內部的非共價鍵，-S-S-等斷裂，部分包裹于分子內部的不溶性蛋白分子釋放出來并擴散至溶劑中，蛋白的游離巰基含量和表面疏水性指數增大，從而使蛋白的致敏性發生一定程度的改變。

2.2 化學處理對花生致敏蛋白的影響

二硫鍵存在時，致敏蛋白具有致敏性。二硫鍵被硫氧降解為硫氫基后，致敏蛋白的致敏性就會消失。Aminlari M等在研究中發現在蛋白中添加一定量的還原劑，例如NaSO3和Cys（半胱氨酸），是改變二硫鍵從而改善蛋白PDI的有效方法。Fukushima D等在研究中也得出了類似的結論。由于NaSO3和Cys都是對二硫鍵有特異性的還原劑，因此一些學者將這一結果解釋為還原劑的使用打破了蛋白中的二硫鍵，也就是說，導致蛋白質溶解度下降的原因是二硫交聯。因此，本研究也考察了還原劑的添加對蛋白致敏性的影響，試圖利用還原劑處理蛋白來降低其致敏性，但從圖1中可以看出，還原劑-1及還原劑-2都未改變花生致敏蛋白的分子量分布。

總體來講，物理方法及化學方法雖然能降低一定的致敏性但效率不高。蛋白分子上的抗原決定簇（表位）有空間表位和線性表位2種，物理及化學2種變性方式只在一定程度上破壞了空間表位，但線性表位卻很難遭到破壞。

2.3 酶處理對花生致敏蛋白的影響

利用微生物或酶制劑催化蛋白質發生化學反應屬于生物改性，可以改變蛋白質的基本結構，同化學反應相比它的反應專一、條件緩和、易于控制，越來越受到人們的重視。轉谷氨酰胺酶是一種可以導致蛋白質（或多肽）之間發生共價交聯形成共價化合物的聚合酶。

酶處理對花生致敏蛋白的影響見圖2。

圖2 酶處理對花生致敏蛋白的影響Fig.2 Effect of enzyme polymerization on allergic proteins of peanut

從圖2可以看出，隨轉谷氨酰胺酶加酶量的增加，中低分子量的蛋白逐漸聚合成大于175 ku的蛋白，63.2、53.2、47.4、41.6 ku 的致敏蛋白含量及致敏性逐漸降低。這可能是由于蛋白在交聯與聚合的過程中，抗原決定簇的結構發生了掩蓋或改變，或普遍提高了免疫原性，從而影響了致敏能力。El fadilE[9]等對大豆蛋白致敏性研究時，也發現了類似的情況。

3 結論

物理方法及化學方法雖然能降低花生蛋白一定的致敏性但效率不高。隨轉谷氨酰胺酶加酶量的增加，中低分子量的蛋白逐漸聚合成大于175 ku的蛋白，63.2、53.2、47.4、41.6 ku 的致敏蛋白含量及致敏性逐漸降低。

由于反應的復雜性，使加工處理過程中增加或者降低抗原蛋白的致敏性都有著可能，抗原在加工存儲過程中不僅有被破壞的可能，同樣也有形成新抗原的可能，因此如何控制反應條件并保證食品的安全性還有待進一步研究。

[1]Roland E Poms,Claudia Capelletti,Elke Anklam.Effect of roasting history and buffer composition on peanut protein extraction efficiency[J].Mol Nutr Food Res,2004,48:459-464

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Effect of Modified Process on the Allergenic Property of Peanut Proteins

WANG Shuo1，2，WU Hai-wen1，QIU Zhi-long2，RU Hai-jian2，GAO Mei-xu1，LI Shu-rong1，*
（1.Institute of Agro－food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Agricultural Product Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China；2.Shenyang Product Quality Supervision and Inspection Institute，Shenyang 110022，Liaoning，China）

The effect of different modified process on allergic peanut proteins has been studied by detection of peanut protein SDS-PAGE and Western Blot patterns.Results showed that the majority of peanut proteins kept stable against physical and chemical modified.With the increase of enzyme transglutaminase,content of 63.2,53.2,47.4 and 41.6 ku allergenic protein and the allergenicity reduced gradually.

modified;peanut;allergic protein

中國農業科學院院所創新基金

王爍（1983—），女（漢），助理工程師，碩士，主要從事生物化學及食品輻照技術的應用和研究。

*通信作者

2010-08-24