牛胎盤廢棄物制備食品微生物培養基

沈棚，牟德華 ，李艷，葉潤

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

牛胎盤廢棄物制備食品微生物培養基

沈棚，牟德華*，李艷，葉潤

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

采用廢棄牛胎盤下腳料為氮源制備新型培養基。并采用Plackett-Burman法、最陡爬坡試驗和響應面試驗（Box-Behnken設計法）相結合的方法對大腸桿菌培養基進行優化。結果表明：牛胎盤下腳料經水解后，替代LB培養基中的酵母浸粉，顯示出較高的生長水平。優化后的新型培養基（NTP）組成為：葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L，胰蛋白胨10.3 g/L，牛胎盤水解物16.7 g/L，pH 7.85，最終得到活菌數量較高的培養基配方。

牛胎盤；培養基；響應面；優化

胎盤在中醫藥學中稱為紫河車，是哺乳類胎生動物在懷胎時為胎兒供應養分，促進胚胎生長的特殊組織。它作為妊娠期間母體與胎兒進行物質交換的紐帶，具有重要的生理功能，可分泌多種激素、酶類；其組成成分復雜，含有多種蛋白質、抗體、磷脂、生長因子、細胞因子及能刺激抗體免疫系統的小分子活性物質[1-2]。目前關于牛胎盤在食品或食品用微生物培養方面的應用研究較少，主要研究為提取其中少量的活性因子[3-4]。而剩余的大部分下腳料仍含有較高的蛋白質，一直作為廢物丟棄，既污染環境又浪費蛋白質資源。

響應面分析方法，由一組數學和統計學方法組成。可用于確定各因素及其交互作用在加工過程中對非獨立變量的影響，精確地表述因素和響應值之間的關系。可快速有效地確定多因子系統的最佳條件[5]。本試驗利用牛胎盤下腳料廢棄物，經水解濃縮后，為微生物提供優質的氮源，制備新型培養基（NTP培養基），不僅降低了成本，還有很高的經濟利潤，為畜牧業增加副產值。進一步通過響應面設計優化大腸桿菌培養基，以期獲得活菌數量較高的培養基配方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌E.coliK12：河北科技大學微生物研究室保藏菌種。

1.1.2 培養基（質量分數）

LB培養基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%，pH 7.0；

NTP培養基：胰蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，牛胎盤水解物0.5%，NaCl 1%，pH 7.0。

1.1.3 試劑

復合蛋白酶：和氏璧生物技術有限責任公司；牛胎盤：河北君樂寶乳業有限公司提供。

1.2 儀器

YPW-I型迴轉式恒溫調速搖瓶柜：上海通特電訊電設備廠；YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-GJ-1BU潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；UV-2102 PCS型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理工藝

牛胎盤下腳料→烘干、粉碎→復合蛋白酶水解（加酶量 5000 U/g，溫度 53 ℃，pH6，料液比 1:10，水解2.5 h）→離心→牛胎盤水解液→濃縮→4℃冷藏

1.3.2 檢測方法

試驗采用比濁法測定培養液OD值。比濁法是根據細菌懸液細胞數與混濁度成正比，與透光度成反比關系，利用光電比色計測定細胞懸液的光密度（即OD值），用于表示該菌在本實驗條件下的相對生長量[6-7]。

測定方法：每隔一定時間間隔取樣搖勻，將大腸桿菌培養液進行適當稀釋，使光密度在0.1～0.65之間，以沒有接種的空白對照組液體培養基調零點，在600 nm波長，1 cm比色杯中依次測定OD值，以光密度（OD值）為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制大腸桿菌的生長曲線。

1.3.3 培養條件

種子培養條件：250 mL三角瓶裝種子培養基50 mL，接斜面活化后的種子一環，37℃，180 r/min，旋轉振蕩培養18 h。

發酵培養條件：250 mL三角瓶裝發酵培養基50 mL，按照2%的接種量接種后在37℃，180 r/min，旋轉振蕩培養24 h。

1.3.4 優化方法

Plackett-Burma設計：本試驗在前期單因素試驗的基礎上選用N=12的Plackett-Burman設計法，對培養基的5個因素的重要性進行考察，每個因素取高低2種水平，以培養液的OD600為響應值，試驗設計見表1。用minitab15軟件對試驗數據進行處理，比較各因素重要性。

最陡爬坡試驗：根據Plackett-Burman試驗結果，以各顯著因素的正負效應確定最陡爬坡試驗的路徑（包括變化方向和變化步長），快速的逼近最大響應區域。而其他因素的取值則根據正效應因素均取較高值，負效應因素均取較低值的原則。找到下一步響應面分析的中心點。

Box-behnken設計：響應面分析實驗方法根據PB試驗設計和最陡爬坡試驗結果，以最陡爬坡試驗得出中心點，設計三因素三水平的優化試驗。用minitab軟件設計Box-Behnken響應面實驗并進行數據處理。

2 結果與討論

2.1 NTP培養基試驗結果

分別采用NTP新型培養基和LB培養基培養大腸桿菌的生長曲線如圖1所示。

圖1 NTP培養基培養大腸桿菌生長曲線Fig.1 The growth curve of E.coli cultured by NTP medium

由圖1可知，當采用相同含氮比例的牛胎盤水解液代替LB培養基中的酵母浸粉時，NTP新型培養基最終活菌含量略高于LB培養基，其原因是牛胎盤下腳料的蛋白水解液中，含有一定的活性多肽，有利于微生物的生長，表明采用NTP培養基適合于大腸桿菌的培養。

2.2 大腸桿菌培養基優化

2.2.1 影響因素的篩選

按照Plackett-Burman設計，在培養穩定期時取樣測定600 nm條件下的OD值，Plackett-Burman試驗設計及結果見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Design and results in Plackett-Burman experiment

對表1進行回歸分析，所得結果列于表2。

表2 各因素水平、效應值及顯著性分析Table 2 Factors，levels，effects of value and statistical analysis in Plackett-Burman experiment

由表2可看出，胰蛋白胨、牛胎盤水解物、pH、表現為正效應，氯化鈉、葡糖糖表現為負效應。可信度大于85%的因素為胰蛋白胨、牛胎盤水解物、pH，其中胰蛋白胨、牛胎盤水解物的可信度大于90%，影響顯著。因此確定胰蛋白胨、牛胎盤水解物、pH為主要影響因素進行下一步試驗。

2.2.2 最陡爬坡試驗

根據表2分析結果確定不顯著因素的水平，表現為正效應因素取較高值，表現為負效應因素取較低值，安排如下:葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L。顯著因素的變化步長及方向的試驗計及結果見表3。

從表3可看出，最佳因素濃度處于第4組與第5組實驗之間，第4組產量最高，因此以第4組的水平作為響應面實驗的中心點，即胰蛋白胨8 g/L，牛胎盤水解物 14 g/L，pH7.7。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table 3 Design and results in the steep hills experiment

2.2.3 Box-Behnken試驗設計及結果

通過最陡爬坡試驗確定了重要影響因素的取值區間。以胰蛋白胨、牛胎盤水解物及pH 3個重要因素為自變量，各因素編碼水平如表4所示。Box-behnken試驗設計及結果如表5所示。

表4 Box-Behnken設計的變量及水平Table 4 Variables and levels in Box-Behnken design

表5 Box-behnken設計及結果Table 5 Design and results in Box-Behnken

對試驗結果進行回歸擬合，得到回歸方程為:Y=-88.22-327.68X1-374.32X2+24.60X3-7683.17X12+2921.08X1X2+55.64X1X3-2.2457X22+80.19X2X3-1.69X32回歸方程的方差分析見表6。

從表6可以看出，模型是顯著的（P=0.002），失擬項p=0.063，表明失擬不顯著，方程的相關系數R2為0.9719，調整后的R2為0.9212。表明模型能解釋92.21%菌量的變化，回歸擬合程度較好，可以用此模型對培養液的活菌含量進行預測。

表6 回歸方程的方差分析Table 6 The variance analysis of regression equation

2.2.4 最佳濃度的確定及驗證實驗

對回歸模型進行響應面分析，得到各響應面立體分析圖，見圖2～圖4。

圖2 Y=f(X1，X2)的響應面立體分析及其等高線圖Fig.2 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X1,X2)

圖3 Y=f(X1,X3)的響應面立體分析及其等高線圖Fig.3 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X1,X3)

從圖2～圖4中可看出，兩兩因素間存在比較明顯的交互作用，最佳點落在實驗考察的區域內。

由圖及軟件分析可知，回歸方程存在穩定點。當X1，X2，X3分別為：10.3、16.7 和 7.85 g/L 時，響應值 Y達到最大值3.53，即培養液的活菌含量最高。所得的實際培養液OD600平均為3.49，與預測值接近，可見該模型能較好的預測實際情況；而在未優化培養基條件下的培養液OD600=1.995，可見優化后的培養基能顯著提高培養液中的活菌含量。

圖4 Y=f(X2,X3)的響應面立體分析及其等高線圖Fig.4 Stereo analysis and contour map of the response surface,Y=f(X2,X3)

3 結論

以牛胎盤下腳料為原料，經蛋白酶水解后，制備新型NTP培養基，用于大腸桿菌培養，可明顯提高活菌數量，從而實現了廢棄物再利用。

通過Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗及Box-behnken設計的方法確定大腸桿菌培養的最適培養基為：葡萄糖2.8 g/L，NaCl 11 g/L，胰蛋白胨10.3 g/L，牛胎盤水解物16.7 g/L，pH 7.85。進一步研究NTP培養基在其他微生物發酵培養中應用，用牛胎盤下腳料水解物替代酵母浸粉能夠在微生物的大規模培養中提供質優的生長因子，具有很好的應用前景。

[1]李魯龍，劉月文.牛胎盤營養成分的分析[J].中國乳品工業，2000，28(2):39-40

[2]高麗英，尚海忠，張壽，等.高原牦牛胎盤營養成分的測定與分析[J].畜牧與飼料科學，2009，30(1):31-32

[3]牟德華，李艷，趙玉華.牛胎盤生物活性物質的研究進展[J].河北工業科技，2006，23(3):120-123

[4]房新平，生慶海，王玉良，等.酶法水解牛胎盤下腳料[J].中國乳品工業，2005，33(3):35-38

[5]Xin-ping Fang,Wen-shui Xia,Qing-hai Sheng,et al.Purification and characterization of animmunomodulatory peptide from bovine placentawater-solubleextract[J].PreparativeBiochemistry&Biotechnology，2007,37(3):173-184

[6]劉志祥，曾超珍.響應面法在發酵培養基優化中的應用[J].北方園藝，2009(2):127-129

[7]饒可揚.《大腸桿菌生長曲線測定》實驗方案的改進[J].大連教育學院學報，1995(1):109-110

[8]張麗靖，陳志良，楊郁.納豆菌體外抑制大腸桿菌的培養基優化[J].2009，19(1):41-42

Using Bovine Placenta Scraps to Prepare Food Microbiology Medium

SHEN Peng,MOU De-hua*，LI Yan,YE Run
（College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

Bovine placenta scraps were used as a new nitrogen source for a new medium in this study.Plackett-Burman method,steep hills test and responses surface（Box-Behnken design）method were adopted to optimize the culture medium of the E.coli.Results showed that the E.coli had a higher growth level,after hydrolysis of bovine placenta scraps,which,thereafter,replaced yeast powder immersion in LB medium.The new optimized medium（NTP）was composed of glucose 2.8 g/L，NaCl 11 g/L，tryptone 10.3 g/L，bovine placenta hydrolysis content 16.7 g/L，pH 7.85.A medium formula with greater living bacterium content was achieved Eventually.

Bovine placenta；medium；responses surface methodology；optimization

河北科技大學生2010年度大學生科技創新基金項目（10253）

沈棚（1987—），男（漢），在讀本科生，研究方向：天然產物的分離研究。

*通信作者：牟德華（1960—），男，教授，主要從事農產品深加工以及天然產物分離的研究。

2010-08-30