枇杷葉中齊墩果酸的提取工藝

樊愛萍，劉衛(wèi)，閔勇，李四麗

（紅河學(xué)院理學(xué)院化學(xué)系，云南 蒙自 661100）

枇杷葉中齊墩果酸的提取工藝

樊愛萍，劉衛(wèi)*，閔勇，李四麗

（紅河學(xué)院理學(xué)院化學(xué)系，云南 蒙自 661100）

以微波法進(jìn)行提取,采用最優(yōu)的薄層分離-比色顯色法測(cè)定齊墩果酸含量，確定出微波提取的最佳工藝為：乙醇濃度95%、提取功率為630 W、微波時(shí)間為70 s、料液比為1:20（g/mL）。微波法與傳統(tǒng)的熱回流法、冷浸取法進(jìn)行比較，得出微波法的提取率為84.8%，熱回流法的提取率為64.1%，冷浸法的提取率為61.3%，即微波法提取率明顯高于其他2種方法，且結(jié)果顯示微波法提取齊墩果酸有效可行。

枇杷葉；齊墩果酸；微波；提取

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Eriobotryajaponica（Thunb Lindl）的干燥葉，現(xiàn)代藥學(xué)測(cè)驗(yàn)，枇杷葉含有皂苷、苦杏仁苷、烏索酸、齊墩果酸、鞣質(zhì)、VB1、VC等化學(xué)成分[1-2]，其中齊墩果酸是一種重要的成分，由于其廣泛的生物學(xué)活性，它具有非常高的藥用價(jià)值，如抗腫瘤、保肝作用和降血脂、血糖及抗艾滋病等作用外[1]，還具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集和抗氧化等多種藥理作用[3]。由于齊墩果酸結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，人工合成較困難,從天然產(chǎn)物中提取齊墩果酸是獲得齊墩果酸的主要途徑。從天然產(chǎn)物中提取的齊墩果酸對(duì)動(dòng)物無(wú)明顯的毒、副作用，現(xiàn)在歐美國(guó)家現(xiàn)以將其加工成保健食品，或者作為天然抗氧化劑應(yīng)用到食品中[4]，齊墩果酸具有很大的開發(fā)前景。

目前大部分研究人員對(duì)齊墩果酸的提取大都采用傳統(tǒng)熱回流法、索氏提取法、冷浸提取法[5]等方法，而用微波法進(jìn)行提取的研究鮮見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

枇杷葉：采自云南蒙自枇杷基地。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備和藥品

微波爐：德國(guó)進(jìn)口，SMC；離心機(jī)：常州國(guó)華電器有限公司；7200型分光光度計(jì)：尤尼柯-上海儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)；電熱干燥箱：9030（A）101（A）－0（S）南京沃環(huán)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52上海比朗；薄層G板；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；香草醛；冰醋酸；高氯酸；乙醇；濃硫酸；硅膠層析粉；氯仿；丙酮等。

1.2 方法

1.2.1 齊墩果酸測(cè)定方法研究

薄層分離-比色顯色：取1mL供試樣，標(biāo)準(zhǔn)液1mL，分別點(diǎn)于同一硅膠板上，以氯仿-丙酮（4:1）為展開劑展開，取出，揮去溶劑，在對(duì)照品部位噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃烘箱中烘7 min～8 min至顯示紫紅色，刮取與對(duì)照品相同位置以及等面積的斑點(diǎn)置于離心試管中，同時(shí)刮取等面積空白硅膠作為試劑空白。先精確加入新制的5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，振搖溶解后加入高氯酸0.8 mL，用封口膠封閉，搖勻后置于70℃水浴中加熱15 min，然后流水冷卻，再加乙酸乙酯4 mL，搖勻，離心取上層清液在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定。

1.2.2 完全提取實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量1.0000 g枇杷葉粉末于錐形瓶中，按料液比為1:20（g/mL），以95%乙醇在630 W功率下提取3次，再按1:10料液比95%乙醇提取2次，每次提取70 s，合并提取液，定容于100 mL容量瓶中，用薄層分離-比色顯色法測(cè)定吸光度。并根據(jù)以下公式計(jì)算提取率:

2 結(jié)果與分析

2.1 Rf值的確定結(jié)果

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，用氯仿-丙酮（4:1）展開劑展開后，確定出齊墩果酸的比移值為 0.926、0.933、0.933、0.900，取其平均值為0.930，0.900值偏低的原因可能是點(diǎn)樣不均勻以及展開劑比例不夠精確引起的，故在以后試驗(yàn)過(guò)程中取樣時(shí)按比移值0.930進(jìn)行取樣測(cè)定。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定結(jié)果

紫外分光光度計(jì)掃描齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)果，如表1所示。

表1 紫外分光光度計(jì)掃描結(jié)果Table 1 Ultraviolet spectrophotometer scanning results

由所測(cè)吸光度值可知，在波長(zhǎng)為538 nm時(shí)吸光度值最大，故選擇538 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計(jì)算得回歸方程為：A=0.1511C-0.17673，r=0.99638, 在 4 μg/mL～20 μg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖1。

圖1 齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Oleanolic acid standard curve

2.4 測(cè)定方法的研究

有文獻(xiàn)報(bào)道[6]采用比色法測(cè)定木瓜中的齊墩果酸含量，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)，所得枇杷葉提取液顏色呈深綠色，即枇杷葉中的色素也大量溶出，對(duì)其溶液直接進(jìn)行顯色測(cè)定，使其測(cè)定結(jié)果偏高很多，所以直接用比色法測(cè)定并不適用于枇杷葉中齊墩果酸含量的測(cè)定。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道[7]采用薄層分離-分光光度法測(cè)定威靈仙的齊墩果酸含量，但通過(guò)將枇杷葉提取液用薄層分離后，在比移值范圍內(nèi)取樣、洗脫，在洗脫過(guò)程中易造成洗脫不完全，增大測(cè)定誤差，使測(cè)定結(jié)果偏低，另外用洗脫劑洗脫一方面增加成本，另一方面也使工序更為復(fù)雜，增加測(cè)定以及計(jì)算難度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用薄層分離-比色顯色法能消除枇杷葉提取液中色素等雜質(zhì)的干擾，且跑版后，不需洗脫劑洗脫，而直接取樣顯色，一方面簡(jiǎn)化操作、節(jié)省時(shí)間、降低成本，另一方面可減小操作誤差，提高齊墩果酸的顯色靈敏度，使測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。故本實(shí)驗(yàn)選取該法為測(cè)定方法。

2.5 微波提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 乙醇濃度對(duì)枇杷葉中齊墩果酸的影響

采用75%、80%、85%、90%、95%不同濃度的乙醇-水溶液為提取劑提取齊墩果酸，測(cè)定提取液的吸光度值，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.2 Effects of ethyl alcohol density on extraction rate

圖2表明，齊墩果酸的吸光度值隨乙醇濃度的增大而逐漸增大，但隨著乙醇濃度的增加，色素等雜質(zhì)的溶出也越多，對(duì)測(cè)定造成很大干擾,且隨著溶劑濃度的增加，其成本會(huì)隨之增加。由圖2可知在85%～95%乙醇濃度時(shí)，吸光度值趨于平緩，故從提取率及成本考慮，選取85%、90%、95%作為正交試驗(yàn)濃度因素的3個(gè)水平。

2.5.2 提取功率對(duì)枇杷葉中齊墩果酸的影響

采用 350、420、490、560、630 W 不同微波功率提取齊墩果酸，測(cè)定提取液在的吸光度值，結(jié)果見圖3。

圖3 微波功率對(duì)提取率的影響Fig.3 Effects of microwave power on extraction rate

圖3表明，微波功率過(guò)低（320 W），齊墩果酸的提取會(huì)不完全，而微波功率過(guò)高（＞560 W）時(shí)，使乙醇沸騰，使提取劑的量減少，且對(duì)齊墩果酸的結(jié)構(gòu)造成破壞，所以當(dāng)功率達(dá)560 W后，增加功率會(huì)使齊墩果酸的提取率下降。所以本試驗(yàn)選取490、560、630 W作為正交試驗(yàn)的微波功率因素的3個(gè)水平。

2.5.3 提取時(shí)間對(duì)枇杷葉中齊墩果酸的影響

采用 50、60、70、80、90 s不同提取時(shí)間提取齊墩果酸，測(cè)定提取液的吸光度值，結(jié)果見圖4。

圖4 微波輻射時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effects of microwave irradiation time on extraction rate

由圖4可以看出，吸光度值隨提取時(shí)間的增大而增大，在80 s時(shí)吸光度值達(dá)最大，之后隨提取時(shí)間的增加吸光度值反而降低，這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，微波提取溫度會(huì)隨之增加，長(zhǎng)時(shí)間受熱會(huì)造成齊墩果酸分解，故本實(shí)驗(yàn)選取70、80、90 s作為正交試驗(yàn)的提取時(shí)間因素的3個(gè)水平。

2.5.4 料液比對(duì)枇杷葉中齊墩果酸的影響

采用 1:10、1:15、1:20、1:25、1:30（g/mL）不同料液比提取齊墩果酸，測(cè)定提取液在的吸光度值，結(jié)果見圖5。

圖5 微波處理液料比對(duì)提取率的影響Fig.5 Effects of microwave dealing solvent to material on extraction rate

由圖5得知，當(dāng)料液比低于1:10時(shí)枇杷葉粉末不能被完全浸泡，達(dá)不到提取效果，當(dāng)在1:20時(shí)吸光度值達(dá)到最大，隨著料液比的增加，吸光度值下降，可能是因?yàn)檩^高的料液比使得微波在一定能量下加熱更多的溶液，達(dá)不到提取溫度，所需時(shí)間延長(zhǎng)，吸光度值下降，所以本實(shí)驗(yàn)選取 1:15、1:20、1:25 作為正交試驗(yàn)的料液比因素的3個(gè)水平。

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選微波提取工藝

通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察乙醇濃度、提取功率、提取時(shí)間、乙醇用量4個(gè)因素，按L9（34）安排正交試驗(yàn)，見表 2、3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Orthogonal design of separation

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal design and results of separation

從表3中方差結(jié)果分析可以得出，4個(gè)單因素對(duì)齊墩果酸的影響大小順序?yàn)橐掖紳舛龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間＞提取功率，且枇杷葉中提取齊墩果酸的最佳提取條件為A3B3C1D2，即乙醇濃度為95%，提取功率為630 W，提取時(shí)間為 70 s，料液比為 1:20。

2.7 提取方法的比較

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得到熱回流以及冷浸取中1 g枇杷葉提取得到的齊墩果酸的吸光度值，以及與微波法比較的結(jié)果見表4。

表4 對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of comparative experiments

從3種提取方法的比較結(jié)果得出，在提取時(shí)間、料液比及提取率上微波法明顯優(yōu)于其他2種方法。微波能有效節(jié)約提取時(shí)間以及很好的控制提取溫度，保護(hù)活性物質(zhì)的功能成分不被破壞，所以本實(shí)驗(yàn)采用微波進(jìn)行提取，并通過(guò)單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出最佳提取工藝條件。

2.8 完全提取結(jié)果

經(jīng)過(guò)5次提取后，枇杷葉中的齊墩果酸幾乎被完全提取，由公式（1）計(jì)算得到枇杷葉中齊墩果酸的含量為 901.208 μg/g。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)齊墩果酸測(cè)定方法研究以及微波提取單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)選微波提取工藝的試驗(yàn)，得出以下結(jié)論：

1）經(jīng)過(guò)3種測(cè)定方法的研究比較得出，薄層分離-比色顯色法應(yīng)用于測(cè)定枇杷葉中的齊墩果酸，結(jié)果更可靠、更有針對(duì)性。

2）由單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得出微波提取枇杷葉中齊墩果酸的最佳工藝路線為：乙醇濃度95%、提取功率為630 W、微波時(shí)間為70 s、料液比為1:20。

3）經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出微波法的提取率為84.8%，熱回流法的提取率為64.1%，冷浸法的提取率為61.3%，且從3種提取方法的條件比較得知，微波法在提取時(shí)間、料液比上微波法明顯優(yōu)于其他兩種方法，能更大程度的節(jié)約時(shí)間，降低能耗以及成本，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)工藝。

4）經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得出蒙自枇杷葉中齊墩果酸的含量為901.208 μg/g。

[1]林玉霖，林文津，林力強(qiáng).枇杷葉的研究現(xiàn)狀與開發(fā)前景[J].中藥材，2006，29(10)：1111-1114

[2]國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站.植物藥有效成分手冊(cè)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1986:800

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Study on Extraction of Oleanolic Acid from Eriobotrya Japonica

FAN Ai-ping，LIU Wei*，MIN Yong，LI Si-li
（School of Science Honghe University，Mengzi 661100，Yunnan，China）

Microwave extraction method,using the best thin-layer separation-Colorimetric Determination of Color oleanolic acid content,identify the optimum microwave extraction as follows:95%ethanol concentration,extraction power of 630 W,microwave time 70 s,solid-liquid ratio of 1:20.Microwave method and conventional thermal reflux method,the cold soak comparison emulated obtained by microwave method of extraction rate of 84.8%,heat reflux extraction rate was 64.1%,the cold soak method of extraction rate was 61.3%,or microwave extraction was significantly higher than the other two methods,and the results showed that microwave extraction of oleanolic acid to be effective.

eriobotrya japonica（Thumb.）Lindl;oleanolic acid;microwave;extraction

紅河學(xué)院碩士專項(xiàng)基金（XSS07011）

樊愛萍（1977—），女（漢），講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)研究。

*通信作者：劉衛(wèi)，教授，主要從事有機(jī)化學(xué)及天然產(chǎn)物研究。

2010-08-09