產紫紅色素菌株的篩選及誘變

胡博涵劉素純何 理李海飛

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；4.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640）

產紫紅色素菌株的篩選及誘變

胡博涵1劉素純2，3何 理4李海飛1

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；4.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640）

以土壤和3種水果為樣品，馬鈴薯－抗生素培養基為基質，采用稀釋平板法分離產紫紅色素的菌株，并以產紫紅色素菌株為出發菌株進行紫外誘變。結果表明：從蘋果表面上獲得1株產紫紅色素的真菌，通過個體形態和菌落特征初步分析為鐮孢菌屬菌株（fusarium sp.），該菌以馬鈴薯－蔗糖（35%）為基質發酵，獲得胞內紫紅色素OD值為0.790，胞外色素OD值為0.538，該突變菌株獲得其胞內紫紅色素OD值為0.895，胞外色素OD值為0.503，且該突變菌株產生色素的速度要快于出發菌株1 d。

紫紅色素；OD值；誘變

科技的發展使合成色素在食品中使用造成人體健康危害的證據得以證實。近年來，食品行業的“蘇丹紅”事件被頻頻曝光，使人們對食品色素的安全性格外警惕，甚至談“紅”色變。雖然各種合成紅色素色澤鮮艷、著色力強［1］、堅牢度大、性質較穩定，但與合成色素相比，天然色素具有無毒副作用、安全性高［2］，有一定的營養價值和保健功能［3－6］，著色比較自然，更接近于天然物質的顏色等特點［7－8］，在現代食品工業發展中正逐漸被重視。它不僅廣泛應用于干料、酒類、糕點、糖果等飲料和食品當中，而且也應用于醫藥和化妝品的生產中［9］。自然界中能產生色素的微生物種類非常豐富［10－11］，利用微生物資源進行液態發酵或固態培養產紅色素，能克服以動植物為原料生產天然色素的諸多缺點，不受資源、環境和空間的限制，并且易于工業化，是高效、低成本獲得天然色素的有效途徑，成為天然色素來源的主流。本試驗以土壤和水果為材料，通過菌株篩選和誘變，得到高產紫紅色素菌株，并對其發酵條件優化進行研究，為真菌色素的進一步開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

土壤：取自湖南農業大學實驗基地；蘋果、葡萄、柑橘：市售。

1.1.2 培養基

馬鈴薯－抗生素培養基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，p H自然，添加鏈霉素10～50 mg或氯霉素12.5～25 mg，定容1 L。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L。

SDAY培養基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母10 g，瓊脂20 g，水1 L。

察氏培養基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7 H2O）0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，水1 L。

淀粉培養基：可溶性淀粉15 g，酵母膏4 g，瓊脂20 g，水1 L。

酵母蔗糖培養基：酵母膏20 g，蔗糖150 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，水1 L。

種子培養基：馬鈴薯200 g，及蔗糖20 g，水定容為1 L，p H自然。

發酵培養基：馬鈴薯180～220 g，及蔗糖或葡萄糖20～30 g，水定容至1 L，p H自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離 取樣品25 g放到裝有225 m L無菌含有玻璃珠的生理鹽水的500 m L三角瓶中，搖蕩20 min，作系列稀釋度，取稀釋液10－1、10－2及10－3各1.0 m L放入無菌平皿；再加馬鈴薯－抗生素培養基10～15 mL混合均勻，靜置1 min，重復2次，于28℃倒置培養72 h；將培養基上有色素的單個菌落轉接到斜面培養基中28℃培養72 h，保存備用。

1.2.2 菌株的微生物學特性及鑒定 將有色素菌株在馬鈴薯液態培養基上28℃倒置培養72 h，進行菌落特征觀察，并用棉蘭水浸片法制作標本片，在顯微鏡下400倍觀察個體形態，根據菌株的培養特性和形態特征，對照《真菌鑒定手冊》，確定其屬。

1.2.3 液態搖瓶發酵 液態搖瓶發酵獲取色素發酵液種子：300 mL的錐形瓶中盛裝種子培養基90～100 mL，接種斜面菌種，培養溫度28℃，培養基初始p H為自然，轉速220 r／min，發酵時間72～84 h，即得搖瓶發酵液。再將發酵種子按5%的質量分數分別接到不同培養基中發酵。

1.2.4 色素測定 發酵后，取發酵液入離心管中置高速離心機中10 000 r／min下離心10 min，得上清液和菌絲體。將收集到的菌絲體于50～60℃烘干5 h，用研缽充分研磨菌絲體，使細胞完全破碎，將獲得的烘干菌體按固液質量比1∶3加入70%～95%（V／V）酒精，浸提4～6 h，離心得上清液。所有上清液均在520 nm處以酒精作參比，測定其OD值。

1.2.5 菌株紫外誘變 采用功率15 W，照射距離20 cm，分別對相同濃度和體積的孢子菌懸液進行紫外處理，時間分別為15，30，60，90 s，將處理過的孢子懸液及對照懸液涂布于平板培養基上，避光28℃培養3 d，統計活菌數并計算致死率，選出最佳誘變計量處理孢子懸液。以菌落大小及顏色為指標進行初篩，以生物量和色價 （OD值）進行復篩［12］。對經紫外線誘變的菌株進行搖瓶培養，選出色素含量增加的菌株。并對誘變菌株作穩定性試驗：將復篩出的菌株繼代5次，選出色素產量穩定的菌株。

2 結果與分析

2.1 紫紅色素菌株的篩選和鑒定

對土壤和水果樣品進行稀釋平板分離獲得1株產紫紅色素的真菌，將產生色素的菌落，用棉蘭水浸片法制作標本片，在顯微鏡下400倍觀察個體形態（圖1）：菌絲有隔，有紫紅色素（圖1（a）），分枝，分生孢子梗分枝或不分枝。小型分生孢子卵圓形至柱形，有1～2個隔膜；大型分生孢子鐮刀形或長柱形，有較多的橫隔，稍彎；足細胞明顯（圖1（b））。

圖1 菌株的個體形態Figure 1 Strain of individual figure

菌落特征觀察：在馬鈴薯液態培養基上28℃倒置培養72 h的菌株，菌落呈圓形為紫紅色，邊緣為全緣狀；菌落質地為最初呈白色絨毛狀，迅速變為紫紅色、紫色，外觀呈絨毛狀，菌絲生長較快，長；馬鈴薯培養基上氣生菌絲白色，淺粉色至紫色，絮狀，絨毛狀，生長迅速（見圖2）。

圖2 菌株的菌落特征Figure 2 Strain of colonies character

根據菌株的培養特性和形態特征，對照《真菌鑒定手冊》，初步斷定為鐮孢菌屬菌株（fusarium sp.）。

2.2 菌株發酵產生紫紅色素的培養基質的篩選

采用PDA培養基、察氏培養基、SDAY培養基、酵母蔗糖培養基和淀粉培養基進行液態搖瓶培養觀察產色素情況，發現只有PDA培養基能使菌株產生紫紅色素。其他培養基除察氏培養基有點紫色外均為無色或黃色。

對PDA培養基中糖的種類和數量進行試驗，結果發現蔗糖和葡萄糖隨著濃度的增加色素量在35%處到達高峰值后迅速下降。說明糖濃度太高使得細胞處于高滲透壓環境而抑制細胞的生長。兩種糖的使用中蔗糖比葡萄糖產生的色素OD高（見表1）。

表1 出發菌株在不同濃度蔗糖和葡萄糖發酵產生色素的OD值Table 1 Optical density of strain pigment using differ concentration sucrose and glucose

2.3 誘變菌株與出發菌株發酵色素的比較

經紫外誘變初篩和復篩獲得一突變菌株L4，該菌落色澤較深而且菌體大，將此菌株L4與出發菌株L0在相同條件下進行液態發酵，發現產生紫紅色素的時間比出發菌株提前1 d，測定其OD值，結果見表2。由表2可知，L4在不同蔗糖濃度下的色素OD值高于L0，而且胞內色素明顯提高，胞外色素低于L0。同時對其誘變菌株傳代5次后進行遺傳穩定性試驗，其色素保持不變。

表2 誘變菌株L4與出發菌株L0色素產生量的差別Table 2 Difference of pigment capacity for mutated strain and original strain

3 結論

微生物色素具有植物色素和動物色素不可比擬的優越性。篩選出有較好開發前景的產色素高產菌株，進行液態發酵或固態培養生產出無毒、高色價的天然紅色素，將其運用于食品色素、制藥色素和化妝品色劑等領域，不僅會為消費者帶來健康，而且會為開發者帶來經濟效益。本試驗篩選的紫紅色素色價較高，顏色純正。進行搖瓶培養后附著在瓶壁上不易清洗，具有很強的著色能力，而且出發菌株胞外色素多，誘變菌株胞內色素產生的速度快，具有極大的開發價值。

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3 朱洪波，鞏江，倪士峰，等.食用天然色素的化學成分及保健用研究概況［J］.西北藥學雜志，2010，25（2）：156～159.

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5 何玲玲，王新，石中亮，等.提板栗殼色素對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用［J］.食品與機械，2006，22（6）：56～57，58.

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7 聶晶，齊興娟.食用合成色素研究動態［J］.中國衛生檢驗雜志，2002，14（1）：58～60.

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10 王君，張寶善.微生物生產天然色素的研究進展［J］.微生物學通報，2007，34（3）：580～581.

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Screening and mutation of amaranth pigment－producing fungus

HU Bo－han1LIU Su－chun2，3HE Li4LI Hai－fei1

（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan410128，China；2.Hunan Provincial Research Center of Engineering and Technology for Fermented Food，Changsha，Hunan410128，China；3.Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，Changsha，Hunan410128，China；4.College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong510640，China）

Dilution plate method was adopted to screen amaranth pigment－producing fungus from soil and fruits using potato－antibiotic culture medium.The result indicated that a fungus strain obtained from apple surface with amaranth pigment－producing activity was identified asFusarium oxysporumby observation of its cell shape and colony characteristics.After fermentation of the original screened strain in potato sucrose－（35%）nutrient medium，the OD values of intracellular and extracellular amaranth pigment were 0.790 and 0.538，respectively.As for the mutation－treated strain，the OD values of intracellular and extracellular amaranth pigment were 0.895 and 0.503.Besides，the mutation－treated strain could finish pigment production one day earlier than the original strain.Our work laid a foundation for the research on production of amaranth pigment from microorganism fermentation.

amaranth pigment；optical density（OD）；mutation

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.03.009

2010年湖南省大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目（編號：SCX1010）

胡博涵（1990－），男，湖南農業大學食品科學與工程專業在讀本科生。E－mail：hubohan＿11＠126.com

劉素純

2011－03－20